人克罗恩氏病与奶中副结核菌—人类关注的热点

巩红霞　巩强

摘要：副结核分枝杆菌能引起反刍动物的慢性肠炎，并有学者提出它也是引发人克罗恩氏病的病原体，但其传播途径目前仍然不是十分明确，然而有些证据却表明人感染此菌是因为食入了污染副结核分枝杆菌的牛奶而遭受感染的，就目前而言，巴氏灭菌是否可以有效的杀灭污染奶样中的菌体，仍是未知数。我们以前已经做过在牛奶中添加副结核菌，通过高温短时的巴氏灭菌（72℃，15s）处理后，发现已经检测不到菌的存在。但是副结核菌是细胞内的病原体，在巨噬细胞中存活，并且呈丛状生长。估计在奶中可以躲避杀灭而残存下来。最近一篇关于爱尔兰的零售奶样本的报道指出副结核菌已成功的从奶样本中培养成活。

关键词：副结核菌；Johne's病；牛奶；巴氏灭菌

1895年Johne和Frothingham首次报道了牛副结核菌，他们从严重感染肠炎的牛肠道中，成功分离出抗酸染色的细菌，接着证明它是引发反刍动物肉芽肿肠炎的病原体，副结核菌临床表现为极其复杂的无法治愈的腹泻、渐进性消瘦并最终死亡。发病时，肠道变皱增厚，不能正常的吸收营养。牛感染途径是通过母体子宫及接触和吸食了副结核菌污染的粪便和奶，但直到3～5岁时才有临床症状，应激反应如分娩、哺乳或寄生虫可以加速临床症状的出现。副结核病引起的经济损失也是巨大的，如在美国有20～40%的奶牛受到感染，有亚临床症状的牛会增加乳腺炎的发生导致产奶量下降。并且本病无特效药进行治疗，唯一减少损失的方法是通过临床进行淘汰和净化。

1副结核菌引发的争议

1.1副结核菌对人类的影响 副结核菌是否是人类的病原菌仍处于争议阶段，但有大量的资料表明，人的克罗恩氏患者中确实分离到副结核菌的存在。而目前感染此菌的奶和肉制品是否存在潜在的危害也不太清楚，本篇讨论的主题是：存在于奶中的副结核菌对消费者有危害吗？巴氏灭菌后副结核菌能残存下来吗？副结核菌是人克罗恩氏病的病原吗？首先证实第一个问题：存在于临床症状和亚临床症状的牛粪便和奶中的副结核菌浓度很低（5～8CFU/50mL的奶），此外有副结核菌的奶也仅发生于个体动物，在加工厂，从许多农场收集到的奶要混在一起，这就进一步稀释了副结核菌的浓度。在1996年，美国一家实验室承担了国家动物健康监测任务：牛奶监测，即关于美国副结核病在牛场传播的综合性研究，在血清学分析的基础上，69个牛场通过血清学分析检测到副结核菌阳性，他们每隔2w收集一次罐装奶样本，持续6w。船运冷冻送达实验室培养和PCR分析，在培养12w后，发现没有副结核活菌存在，并且PCR检测也为阴性。得出的结论是：奶中的副结核菌已被稀释到两种方法均检测不到的浓度。但是奶牛场中，粪便中有大量副结核菌污染奶而使菌残留下来，仍是一个值得关注的热点问题。从克罗恩氏患者的肠组织中检测到的分枝杆菌有：偶发分枝杆菌病、多胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌病和堪萨斯分枝杆菌病，同时也分离培养出副结核分枝杆菌，并通过PCR和DNA序列鉴别出来。

1.2克罗恩氏病的确诊 因为克罗恩氏病的临床症状与副结核病的晚期症状类似，所以有研究者提出副结核菌可能是引发本病的罪魁祸首，有两篇文章描写了从克罗恩氏患者的肠组织中发现了特异的副结核菌的DNA序列，但大部分的研究却表明在克罗恩氏患者中并未检测到副结核菌。克罗恩氏病和副结核菌的潜在的联系，对奶牛场来说已经成为一个不可回避的问题。自从1994年美国报道了在零售巴氏灭菌奶中培养出副结核菌的研究后，表明巴氏灭菌奶后残存的副结核菌会缓慢的生长，但是副结核菌在65℃30min和72℃15s加热处理后，副结核菌能否残存下来的研究结论是高度有争议。因为副结核菌是一个潜在的动物传染病的病原体及它与克罗恩氏病的联系特性，原奶中副结核菌灭活所需的最佳时间和温度条件的研究是目前的热点项目。

2实验研究

2.1巴氏灭菌奶的评估 接下来的工作是去评估两种巴氏灭菌奶即标准方法（63.5℃30min）和高温短时（HTST）杀灭副结核菌的效果，在这个研究中接种了104或107CFU/mL的副结核菌，然后进行上述的处理，对两种方法来说，副结核菌的数量都明显的减少，然而，在每一系列的试验中，奶中仍有残留的副结核菌存活下来。其中一个原因可能是实验时热穿透力不够，因为HTST巴氏灭菌奶是模拟商业灭菌的加热和冷却的条件，热交换是通过循环水加热到特定温度并且热处理过程中奶处于静止状态，但商业性的巴氏灭菌奶有系列的管路和盘子，奶在热处理时会有很大的流速，热穿透非常均匀一致。在将奶经过HTST巴氏灭菌后发现奶中仍含有10～103CFU/mL菌体，无论是用固体还是液体培养基都能在最初添加的102～103CFU/mL经72℃15s加热后检出活菌，但是在10CFU/mL 或CFU/50mL的奶中却没有分离到活菌，研究结论是如果奶中的菌数量高于102CFU/mL就有可能存活下来，但低于10CFU/mL通过HTST就可灭活。

另一个实验进一步比较了原有的方法（65℃30min）和HTST（72℃15s），在奶中添加高浓度（104、106、108CFU/mL）副结核菌，并将变化的温度和时间相结合，结果是，在水浴震荡中浸入一个聚乙烯的小导管，放在65、72、74、76℃下30min，0～30min后仍有活菌存活，这个结果与Grant et al 用带有瓶塞的玻璃管模拟原有的方法结果是一致的。相对来说72℃15s的处理能够有效的杀死副结核菌，因为试验设计巴氏灭菌是模拟气流通过的商业巴氏灭菌奶技术。奶流通过一系列的不锈钢快速加热或冷却产品，管道是弯曲的。两个不同方法的结论是：气流加热奶对充分杀灭污染奶中副结核菌至关重要。

2.2副结核菌复活状态 副结核菌自然属性是呈丛状生长，一般很少以单个菌落的方式存在，所以在巴氏灭菌中对丛状细菌的杀灭是不够的，并且副结核菌是一个细胞内的病原体，在宿主的巨噬细胞中生存，所以在巴氏灭菌的处理过程中可能会因其在细胞内生长而受到保护，有人从未感染副结核菌的牛中提取牛乳腺炎巨噬细胞后，加入副结核菌，然后加到原奶中，进行实验室巴氏灭菌72℃15s后不能培养出副结核菌。这就与以前的实验报告相互矛盾。在这项研究中所模拟的巴氏灭菌的实验室方法也提供了原奶中副结核菌灭活的可靠性评估结果。研究结果表明：原有的方法是能够充分杀灭副结核菌的，因为模拟HTST巴氏灭菌与现有的使用标准是不一致的。标准的HTST方法是加工车间必须有成套的不锈钢盘，并有二次生产区、加热区和冷却区，此外与器具连接成一体的弯曲管的尺寸是一定的，在加热时，奶通过管道能产生强大的气流。

加热后奶中残留的副结核菌能否复活也是人们所关注的另一个焦点问题，许多的实验室用HEYM培养基进行活菌计数，有两个实验室报道应用BACTEC液体培养基是比固体培养基更为敏感，我们也尝试应用液体培养的方法去培养奶中的副结核菌，但均以失败告终，因为奶中的其他杂菌生长速度过快，从而干扰了副结核菌的生长。有实验室也研究了一些净化步骤，如在培养集中加入抗生素来抑制其他杂菌的生长的方法。目前已经有更好的从奶中分离副结核菌的新方法，这个方法就是免疫磁珠法：即在磁珠上包被副结核菌的多克隆抗体来富集副结核菌，通过DNA提取及PCR的检测，免疫磁珠最大能结合105CFU/mL，最小可结合10CFU/mL副结核菌，这个方法比目前的培养法要敏感10倍。

3讨论

奶中副结核菌已成为公众关注的热点问题，考虑到有真菌和非抗酸性细菌的影响，美国一家实验室应用免疫磁珠-PCR法已成功的从30份原奶和31份巴氏灭菌奶中检测到10株和6株副结核菌。然而由于收集的样本量多达1000多份，至少要花费18个月的时间来完成下一步的任务，所以进一步的培养活菌仍然没有结果。

美国农业部始终将这一问题列入重点的监测项目，为保障人民生命安全，我们国家也应在这方面加大监测力度，同时研究人员也应进一步提高奶中副结核菌敏感性的检测，同时还应与当地的农场一道研究和评估从患病牛、加热奶以及初乳中副结核菌污染原奶的程度，得出的数据将有助于副结核病的预防、控制和传播，从而减少不必要的经济损失和降低人畜共患病的发生。

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编辑/申磊