烧伤后脓毒症免疫功能障碍：从机制到临床治疗

2015-03-20李俊聪姚咏明杨红明

感染、炎症、修复 2015年4期

李俊聪　姚咏明　杨红明

（1.解放军医学院，北京 100853；2. 解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048；3. 解放军总医院第一附属医院烧伤科，北京 100048）

李俊聪1,2,3姚咏明2杨红明3

脓毒症是一种由感染所诱发的失控的、持久性全身炎症反应[1]。许多临床资料显示，脓毒症已成为大面积烧伤和严重创伤患者死亡的主要原因之一。传统观点认为早期失控的炎症反应是导致患者死亡的主要原因，众多针对脓毒症早期治疗的措施如液体复苏、抗感染治疗、营养及高级生命支持治疗已有了长足进步，但烧伤脓毒症和多器官损害的病死率仍居高不下。近年来，随着人们对烧伤脓毒症研究的深入，发现烧伤脓毒症患者常伴有严重的免疫功能紊乱，主要表现为对病原菌的反应无能及易感性明显增加，由此导致的二次感染及相关并发症已经成为威胁患者生存的重要因素[2]。然而，时至今日对烧伤后脓毒症状态下机体免疫功能障碍的确切机制及其病理生理意义仍不明确，给烧伤脓毒症患者的临床救治带来诸多困难[3]。因此，进一步探讨烧伤后脓毒症免疫紊乱机制，及时、准确地评价患者的免疫功能，对处于免疫抑制状态的患者及早进行干预，从而防止二次感染所带来的危害，已成为临床医生亟待解决的问题。本文拟对烧伤脓毒症免疫功能障碍机制的研究进展进行综述，为探讨烧伤后脓毒症的合理临床治疗措施提供新思路。

1　烧伤脓毒症免疫功能障碍的病因及相关机制

烧伤伴有的剧烈疼痛、创面组织的坏死、液体丢失及随之发生的休克、感染、应激等均可刺激中枢神经系统，通过“神经-内分泌-免疫网络”直接或间接调节机体的免疫应答。烧伤后机体的免疫应答是复杂多变的，受打击程度、机体自身情况、烧伤后的处理等多方面因素影响。

1.1烧伤后机体免疫功能障碍的病因学分析烧伤创面的变性、坏死组织是引发烧伤后免疫功能障碍的主要原因。创面的持续存在可直接激活凝血、纤溶、激肽和补体系统，使之产生大量的炎性介质，形成含有大量毒素和炎性介质的烧伤焦痂。烧伤患者常伴有休克和细胞供氧不全，而缺氧能显著促使巨噬细胞产生炎性介质，持续抑制T淋巴细胞功能；全身性缺氧可导致快速的炎性反应。严重烧伤后存在着程度不同的创面感染和肠道细菌移位，进而导致内毒素血症和血清TNF-α、高迁移率族蛋白B1（HMGBl）等多种促炎细胞因子水平显著升高[4-5]。患者因高代谢而出现的营养素缺乏，治疗过程中发生的水、电解质、酸碱平衡紊乱，血液制品输入，多次麻醉手术以及局部和全身的抗微生物制剂使用等相关因素，均可对机体免疫功能产生不同影响。可见，严重烧伤后大量组织坏死、应激、休克、感染和营养缺乏等反应一起改变了机体免疫细胞和分子所处的微环境，进而造成烧伤后机体免疫功能障碍[6]。

1.2烧伤后机体免疫功能障碍的相关机制烧伤后免疫紊乱的机制包括如下几个方面：神经内分泌紊乱、炎性介质向抗炎因子漂移和淋巴细胞凋亡与麻痹。在探索烧伤脓毒症发生机制的过程中,人们认识到机体并非一直处于促炎状态，免疫功能紊乱与大量淋巴细胞凋亡及免疫受抑状态密切相关。

1.2.1烧伤后神经－内分泌紊乱对免疫的影响下丘脑－垂体－肾上腺(HPA)轴系统在机体遭受打击后的应激反应调控中有重要作用[7-8]。正常情况下，应激增加糖皮质激素（GC）分泌，激活海马上的糖皮质激素受体，从而抑制促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)释放。烧伤患者对应激的GC反应迟钝，通过对比检验烧伤患者与正常对照人群脑脊液CRF含量发现，前者明显高于后者。烧伤后早期垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH ）增多，皮质醇的释放量大大增加。血浆皮质醇水平在烧伤后第1天达到高峰，为正常浓度的2～6 倍。高浓度的皮质醇可抑制胸腺细胞摄取葡萄糖、溶解淋巴细胞，并促使淋巴组织解体。这是导致淋巴组织萎缩和免疫防御功能损害的主要原因之一。与此同时，烧伤后持续的过度炎症反应又可抑制ACTH对皮质醇的促进作用，导致GC分泌减少，称为“肾上腺功能相对不全”。炎性介质与组织或免疫细胞内的GC受体竞争，可直接下调GC受体的表达，造成GC抵抗。脓毒症时GC能调控过度的炎症反应，直接影响患者的病情发展和预后。临床资料证实，许多烧伤脓毒症患者呈现长时间高代谢、高消耗状态，及时给予GC治疗有助于改善患者预后[9]。

1.2.2烧伤后炎性介质对免疫的影响烧伤后人体抗原呈递细胞包括树突状细胞（DC）、单核细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞很快被激活，它们通过抗原呈递和分泌IL-12、TNF-α等细胞因子启动免疫应答；Th细胞可分为Th1和Th2两个亚群，Th1细胞主要分泌干扰素（IFN）-ɣ、IL-2和TNF-α促进细胞免疫，Th2细胞则分泌IL-4、IL-10、IL-13等促进体液免疫[10]。在烧伤早期以Th1型细胞因子IFN-ɣ、IL-2的分泌为主，随着病情的发展,后期表现为Th2型细胞因子IL-4、IL-10的产生为主。由此可见，脓毒症时发生Th细胞由Th1向Th2方向漂移是脓毒症细胞免疫抑制的重要机制之一。

近年来在探索严重感染的发病机制中，人们发现HMGB1作为重要的晚期炎症介质介导了内毒素的致死效应。严重创、烧伤后机体主要组织HMGB1表达广泛、增高较晚，且持续时间较长，可显著影响T淋巴细胞、DC和巨噬细胞免疫功能，并与脓毒症所致多器官损害密切相关。大面积烧伤患者伤后血浆HMGB1含量与细胞免疫功能指标包括T淋巴细胞增殖活性、IL-2含量、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值呈显著负相关,严重烧伤患者血浆HMGB1水平的持续升高对机体细胞免疫功能异常具有显著影响。提示HMGB1与机体细胞免疫功能紊乱有关，HMGB1很可能是介导创、烧伤脓毒症病理过程中失控性炎症反应和免疫功能障碍的重要调节因子[11]。

1.2.3烧伤后细胞凋亡对免疫功能的影响众多资料显示，烧伤后机体免疫细胞功能障碍是脓毒症发生与发展的重要基础，使得机体不能组织有效的免疫防卫，易罹患医院内感染。随着对脓毒症免疫状态及调节机制研究的日益深入，人们逐渐认识到，循环中DC及T淋巴细胞凋亡增加，Treg凋亡减少可能是脓毒症免疫功能紊乱的关键环节[12]，这也是目前研究的热点所在。

DC是体内重要专职抗原提呈细胞，其数量与脓毒症发生发展关系密切。DC抗原呈递能力下降及其数量减少是免疫功能障碍的重要机制之一。在动物实验中观察到，烧伤后大鼠脾脏及淋巴结中DC数量均有明显减少；利用转基因技术特异性消除小鼠体内DC后，脓毒症动物死亡率明显增加。DC凋亡导致自身成熟障碍、抗原提呈能力下降，还可诱导初始T细胞向负性调节细胞Treg分化。Treg在脓毒症复杂的免疫调控网络中主要发挥负向调控作用，加剧免疫无反应状态。研究表明，脓毒症大鼠CD4+CD25+Treg凋亡率显著低于对照组和假手术组，而反映Treg免疫抑制效应的重要膜表面分子又头翼状螺旋转录因子(Foxp3)、T淋巴细胞毒性相关抗原(CTLA)-4表达和抑制性细胞因子IL-10分泌功能则显著升高。严重烧伤可促进外周血Treg的免疫抑制功能成熟，并刺激大量抑制性细胞因子分泌，使机体免疫功能发生障碍甚至紊乱，特重度烧伤、并发脓毒症及预后不良者表现更明显[13]。

淋巴细胞是免疫反应中的核心功能细胞群，淋巴细胞功能失调是导致免疫功能障碍的重要因素。基础研究和临床研究均显示，脓毒症时淋巴细胞对凋亡刺激的敏感性明显增强，出现大量淋巴细胞凋亡。脓毒症时尽管CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的数目未减少，但CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量明显下降[14]。大量淋巴细胞凋亡诱发免疫应答反应受抑，对临床患者预后及模型动物死亡率有直接影响。在临床上，50%因脓毒症而死亡的患者其外周血淋巴细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降，淋巴细胞凋亡显著增加。在家兔腹腔感染所致脓毒症模型中，术后4 h外周血淋巴细胞明显凋亡，且凋亡率与动物预后密切相关。因此，免疫细胞凋亡是脓毒症免疫功能失调的重要病理生理基础，具有重要的理论意义和实用价值。

2　烧伤脓毒症时机体免疫功能状况的监测

传统观念认为失控性炎症反应是脓毒症的主要病理机制，所以早期大量研究试图通过拮抗TNF-α 或 IL-lβ等促炎因子达到治疗脓毒症的目的，但结果令人失望。近年来人们对免疫功能紊乱在脓毒症发生发展中的重要性日益重视，免疫调节治疗日益成为研究热点。从免疫学角度来讲，有效的免疫干预前必须要对患者免疫功能进行准确及时的评价。严重烧伤后脓毒症病理生理过程复杂，其高病死率可能与免疫监测手段和调理措施缺乏有关。因此，建立有效的免疫功能评价手段，有助于尽早识别严重感染和及时进行免疫干预。

2.1固有免疫功能的监控严重创伤可导致中性粒细胞对吞入异物的杀灭能力严重受抑，对表达调理素结合受体的中性粒细胞数量及其吞入异物的杀灭活性进行测定，有助于判断免疫状况。严重感染时，单核细胞TNF-α 分泌减少、人白细胞抗原(HLA-DR)及共刺激分子CD80/86 表达降低，抗原提呈能力减弱。单核细胞是常用的免疫功能分析指标之一。烧伤面积大于30%TBSA的严重烧伤患者CD14+单核细胞HLA-DR表达于伤后早期即显著下降，且持续于较低水平，提示大面积烧伤可引起机体长时间免疫功能低下[15]。并且严重烧伤并发脓毒症患者的HLA-DR结合抗体量于伤后逐步下降，而非脓毒症患者伤后第5天后持续升高。动态定量监测单核细胞HLA-DR的表达对于了解烧伤患者免疫功能状态及预后判断极有帮助。

2.2适应性免疫功能的监控脓毒症时主要以细胞免疫紊乱为主，表现为T淋巴细胞的功能失调：体外细胞增殖反应明显抑制；IL-2、IFN-ɣ、IL-17分泌减少，IL-10分泌增多；细胞表面CD28表达和T细胞受体密度下降；抑制性表面分子PD-1、TLA4表达明显增多。此外还有CD4+CD25+调节性T细胞比例升高，Thl/Th2比值和CD4+/CD8+T细胞比例的异常改变等。脓毒症时机体出现Thl向Th2漂移的免疫反应，明显损害了细胞免疫功能[16]。不同于HLA-DR，T细胞的这些免疫指标由于缺乏统一的标准和简单易行的方法很难在临床推广。近年来研究报道，通过流式细胞术监控主要免疫效应细胞比例和表型的改变已少量应用于临床，是未来指导临床免疫干预的一个发展方向[17]。

3　烧伤脓毒症临床治疗新思路

烧伤脓毒症是微生物侵袭引起机体反应的综合表现，一旦演变为脓毒性休克或多器官功能障碍综合征（MODS），则治疗困难、预后极差，需要针对发病诱因和发病机制给予预防性治疗。

3.1烧伤脓毒症时针对神经-内分泌紊乱的干预措施烧伤脓毒症时机体交感神经处于持续高活动水平，造成过度的应激反应，机体处于兴奋性中毒和高消耗状态，不利于机体有效地组织免疫防御。因此，早期适时的人工干预交感神经兴奋性可能有利于脓毒症的远期预后。此外，针对肾上腺功能不全、高血糖和胰岛素抵抗的治疗也具有一定免疫调节作用[18]，β2肾上腺素能受体激动剂在一些炎性疾病中应用已有一定成效，其在脓毒症中的潜在作用还在研究之中。

3.2针对细胞因子的干预治疗

3.2.1集落刺激因子近年来临床研究发现，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可在一定程度上改善脓毒症患者免疫功能， GM-CSF可通过促进造血细胞的存活、增殖和分化，提高中性粒细胞/单核细胞、DC的数量而改善免疫功能。GM-CSF能够增加脓毒症大鼠外周血中单核细胞HLA-DR的表达和炎性介质的合成。临床观察发现，脓毒症患者给予GM-CSF治疗，其外周血单核细胞TNF-α分泌明显增加，医院获得性感染发生率明显下降[19]。

3.2.2IFN-ɣIFN-ɣ主要来源于活化的辅助性T(Th)细胞和自然杀伤(NK)细胞，可诱导抗原提呈细胞主要组织相容复合体(MHC)-I/II表达，活化单核/巨噬细胞，促进IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性介质分泌而增强免疫功能。IFN-ɣ可激活中性粒细胞、NK细胞，刺激血管内皮细胞和白细胞合成黏附分子，促进Th1并抑制Th2细胞活化与增殖。研究证实严重感染患者给予IFN-ɣ治疗后，免疫抑制状态得到有效改善，病原体得以清除[20]。

3.2.3IL-7和IL-15脓毒症时IL-7可通过多种途径活化T淋巴细胞、改变T淋巴细胞无能状态、促进T淋巴细胞受体分化、增加细胞黏附分子表达，提升机体免疫功能，从而减少机会病原菌感染。临床研究发现，IL-7治疗后外周血中CD4和CD8细胞数量明显增加，脾脏和外周淋巴结中T淋巴细胞增加了50%[21]。IL-15的主要功能是促进效应T细胞和记忆性T细胞的活化和发育，促进中性粒细胞的存活。动物实验发现IL-15治疗可有效较少脓毒症小鼠T淋巴细胞的凋亡[21]。IL-7和IL-15提升T淋巴细胞功能的作用，为脓毒症免疫调节治疗提供了新的信息。

3.3针对细胞表面共抑制分子的干预

3.3.1PD-1和PD-L1的拮抗剂PD-1是T淋巴细胞表面的共抑制性刺激因子，通过与其配体PD-L1结合抑制T淋巴细胞活化和增殖。研究发现脓毒症患者PD-1表达明显上调，与T淋巴细胞功能异常密切相关。特异性阻断PD-1通路可降低感染导致的病死率。抑制PD-L1能够恢复单核细胞的功能，抑制T淋巴细胞凋亡。临床观察发现脓毒症患者循环血中T淋巴细胞表面PD-l表达明显增加，动物实验证实阻断PD-1通路可提高脓毒症大鼠的存活率，提升病原微生物的清除率。另据报道，PD-1及其配体表达水平与血浆IL-10水平及脓毒症患者的病死率、院内感染发生率呈正相关，提示PD-1/PD-L1表达水平可较好地反映患者的免疫状态[22]。

3.3.2CTLA-4拮抗剂CTLA-4是T淋巴细胞表面的另一类抑制共刺激分子。研究表明，脓毒症小鼠CD8+T细胞、CD4+T细胞和调节性T细胞表面CTLA-4表达明显增多。脓毒症小鼠给予CTLA-4特异性拮抗抗体治疗后，其T淋巴细胞凋亡率明显减少，存活率明显增加[23]。这些研究提示针对CTLA-4通路的特异性干预同样可以改善T淋巴细胞免疫功能，进而改善脓毒症预后。

3.4干细胞干细胞在脓毒症中的免疫调节作用目前尚处在实验阶段。干细胞具有减轻组织损伤、促进受伤组织修复、免疫调节、抗感染及抗细胞凋亡等功能。研究证实给脓毒症小鼠注射人骨髓间充质干胞(MSCs)后，脓毒症小鼠炎性反应和死亡率均下降，IL-10水平增高。研究发现，给予脓毒症模型小鼠静脉注射MSCs，与对照组比较，IL-10、TNF-α和IL-6水平降低，肝肾功能得到改善，血管渗漏性减轻，小鼠存活率增加[24]。MSCs可通过与循环中免疫细胞相互作用而重新调整机体免疫反应，从而改善脓毒症时的免疫反应。

4　展望

目前烧伤脓毒症免疫功能紊乱已日益受到人们重视。今后很有必要针对严重烧伤后免疫功能障碍发生机制、免疫监测和干预途径等一系列重要科学问题，深入探讨免疫功能障碍在烧伤脓毒症发病中的确切作用与临床意义，并提出新的可行的诊断标准及针对性临床干预措施。这将是今后烧伤免疫研究的主攻方向。

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10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04. 014

国家自然科学基金资助(81372053)

杨红明，主任医师（E-mail：hmyang126@126.com）

（2015-11-30）