人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽的筛选及验证

刘 芸　邱妙娟　邱柏钦　李锦梅

（南方医科大学病理生理学教研室，广东省功能蛋白质组学重点实验室，教育部重大疾病的转录组和蛋白质组学重点实验室，广东 广州 510515）

人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽的筛选及验证

刘 芸邱妙娟邱柏钦李锦梅

（南方医科大学病理生理学教研室，广东省功能蛋白质组学重点实验室，教育部重大疾病的转录组和蛋白质组学重点实验室，广东 广州 510515）

目的：利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽，为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法：采用全细胞筛选的方式，通过对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞的4轮筛选和与人前列腺癌上皮PC-3细胞的差减筛选，从噬菌体随机肽库中筛选出与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽，选择丰度较高的一条命名为NTG，用其构建含有增强绿色荧光蛋白（EGFP）的原核表达载体，转化感受态细菌，层析法获得重组蛋白His-NTG-EGFP，测定其分子质量。向A549细胞和PC-3细胞分别加入含有重组蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培养基，荧光显微镜下观察。结果：从第1轮至第4轮，淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，经过PC-3细胞差减筛选，少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。重组表达并纯化得到的His-NTG-EGFP，测定其分子质量为33 kD，与预期相符。荧光显微镜下观察发现，经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的A549细胞表面有绿色荧光分布，经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的PC-3细胞以及经对照蛋白处理的A549细胞和PC-3细胞表面均未出现绿色荧光，说明这一融合蛋白可以特异性结合A549细胞。结论：人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽被成功获得。

肺泡Ⅱ型上皮细胞肺损伤，急性靶向肽 噬菌体展示筛选

急性肺损伤（ALI）是指各种直接和间接致伤因素导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，继而造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全。作为机体重要的免疫屏障，肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT Ⅱ）通过分泌细胞因子、炎症介质参与炎性细胞间的相互作用，对ALI中肺功能维持、组织修复和免疫调节有着极其重要的作用[1-2]。由于A549细胞系具有ATⅡ的结构和生化特征，已被当做常用的ATⅡ细胞模型[3-4]。本研究采用人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞作为模型，利用噬菌体随机肽库筛选与其存在特异性结合的多肽，以期获得能够高效识别并靶向A549细胞的工具分子，实现对ATⅡ的靶向干预，以进一步开发针对ALI等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体。

1　材料和方法

1.1实验材料胎牛血清（FBS）、MEM（Eagles's minimum essential medium）细胞干粉培养基购自美国HyClone公司。蛋白酶抑制剂Cocktail 购自美国Sigma公司。MutanBEST 质粒突变试剂盒购自日本TaKaRa公司；His·BindTMKit 购自美国BD公司；X-gal和IPTG购自广州恒捷亚生物科技公司。噬菌体展示随机环七肽文库（Ph.D.7TMPhage Display Peptide Library Kit）购自美国New England Biolabs 公司（滴度为2.0×1013pfu/ml，宿主菌为E.coli ER2738）；人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞和人前列腺癌上皮PC-3细胞购自美国典型培养物种质库（the American Type Culture Collection, ATCC）（培养条件：10% FBS、0.1 mmol/L非必需氨基酸的MEM培养基）；大肠杆菌BL21（DE3）菌种由本实验室保存；pET14b-MCS-EGFP质粒由本科室自行改造保存。

1.2A549细胞特异性靶向肽的筛选以每孔5×106个细胞将A549细胞铺入10 cm皿中，待长成单层贴壁细胞，弃去培养上清，贴壁的A549细胞用MEM培养基冲洗3次，加入含0.1%BSA的培养基，37 ℃孵育30 min。加入噬菌体肽库原液1×1011pfu， 37 ℃摇床温和振摇孵育10 min，细胞培养箱中继续孵育30 min。弃去未结合的噬菌体上清，细胞用含0.1%BSA的MEM培养基洗涤10次。用PBS和0.25%胰酶混合液（比例1∶1）消化，少量血清终止消化，5 000 r/min离心10 min，取部分离心后的上清（即淘选分离液）测定滴度，其余加入对数期E.coli ER2738进行扩增。扩增后加入1/6体积的PEG/NaCl，颠倒混匀，4 ℃沉淀过夜。沉淀2次后，重悬沉淀于0.02%TBS中，得到噬菌体扩增液，测定噬菌体滴度。重复以上步骤进行第2、3、4轮筛选，各轮筛选得到的淘选分离液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal平皿培养测定噬菌体滴度。PC-3细胞培养于10 cm皿中，待长成单层贴壁细胞，弃去培养基，加入第4轮得到的淘选分离液，孵育30 min。孵育结束后，收集未结合的噬菌体上清，得到差减后的人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性结合噬菌体悬液。

1.3A549细胞特异性靶向肽的氨基酸序列推导取噬菌体克隆扩增液作为模板进行PCR反应，取电泳鉴定为阳性的噬菌体克隆的PCR产物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源七肽的氨基酸序列[5]。

1.4A549细胞特异性靶向肽和EGFP融合蛋白的表达纯化根据测序结果，选择丰度较高的七肽作为插入序列突变方法构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的原核表达载体。上 游 引 物 为：5'-aatactggttcgccttatgagtgc GGCTGCTAACAAAGC CCGAAA GG-3'；下游引物为：5'-acaagcagagtgagt GGATCCCTCGAG CTTGTACA GC-3'。重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞。挑取单菌落，接种于含有氨苄霉素（Amp+）的LB培养液中，培养至600 nm处吸光度（A600）为0.5～0.6时，加入IPTG诱导培养5～6 h。离心收集并超声裂解细菌细胞，收集上清。将上清转入加有Ni2+-NTA氨三乙酸琼脂糖的层析柱中，依照His·BindTMKit操作说明，对重组融合蛋白进行纯化，并过滤除菌定量分析。

1.5A549细胞特异性靶向肽的验证于实验前1 d，以每孔7×103个细胞将A549或PC-3细胞铺入petri皿中。待细胞融合度达到50%～60%，用无血清MEM洗细胞表面3次，加入无血清MEM继续培养30 min。然后加入含有终浓度为10 μmol/L的his-NTG-EGFP蛋白或his-EGFP对照蛋白的无血清MEM培养基，于培养箱中继续培养30 min后吸出培养液，用PBS洗涤细胞，采用正置荧光显微镜观察结果并拍照。

2　结 果

2.1A549细胞特异性靶向肽的筛选结果筛选过程分为2个步骤：首先，通过4轮筛选获得与A549细胞存在高亲和力的噬菌体；然后，将第4轮筛选后得到的淘选分离液加入另一上皮细胞系—人前列腺癌上皮PC-3细胞中孵育，通过1轮差减筛选，收集未结合的噬菌体，最终获得与A549细胞存在特异性结合的噬菌体。前4轮筛选过程中严格控制每轮加入的噬菌体数量为1×1011pfu，以保证筛选结果的稳定性。选择生长状态良好的A549细胞，进行了全细胞模式的筛选。从第1轮至第4轮，淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，而富集倍数在第3轮达到了最大值。富集倍数从上升支到下降支的变化，反映筛选已趋近饱和。即第3轮到第4轮筛选过程中，高丰度序列的富集优势更加明显，而低丰度序列的扩增压力则越来越大的。考虑上述因素，我们的筛选进行了4轮，并利用第4轮的淘选分离液进行差减操作。经过差减筛选，噬菌体的回收率为3.24×10-3，即大部分噬菌体与PC-3细胞发生了结合，而少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。见表1。

表1　人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽噬菌体展示筛选

2.2A549细胞特异性靶向肽的氨基酸序列推导差减筛选后得到的噬菌体克隆进行部分初步测序，获得插入序列并推导出相应的氨基酸序列。结果9条多肽序列出现多次重复，选择丰度较高的一条进行靶向验证，即NTGSPYE，并命名为NTG。

2.3A549细胞特异性靶向肽与EGFP融合表达载体的构建和测序分析为了实现对靶向肽的验证，我们将以上多肽序列与EGFP融合构建原核表达载体。由于序列片段较小，故采用了突变插入的方法，并对克隆进行了测序分析以验证重组构建成功。

2.4A549细胞特异性靶向肽与EGFP融合蛋白的表达和纯化蛋白经IPTG诱导可溶性表达，利用Ni-NTA 亲和层析法对超声后破碎细胞后的上清进行纯化后，得到分子质量约为33 kD的蛋白质条带（图1），且纯度达85%以上。

图1　人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽与EGFP融合蛋白的纯化结果

2.5A549细胞特异性靶向肽的验证融合蛋白或对照蛋白分别与A549细胞和PC-3细胞共孵育30 min，可见，经His-NTG-EGFP 融合蛋白处理后，A549细胞的表面出现绿色荧光分布。而相同条件下，该融合蛋白与PC-3细胞无明显结合。在上述条件下，His-EGFP处理的两种不同细胞表面，均未见荧光出现。实验结果提示，NTG与A549细胞的结合具有一定特异性。见图2（封三）。

3　讨 论

ATⅡ又称颗粒肺泡细胞，分散分布于ATⅠ肺泡细胞（ATⅠ）之间及其相邻的肺泡间隔结合处。在正常的细胞更新及损伤修复过程中，它既可以分化为ATⅠ，也可以通过有丝分裂产生子代ATⅡ以维持自身的细胞群，扮演了肺泡上皮细胞“干细胞”的角色。ATⅡ的增殖、转化与肺损伤及其修复有着密切的关系[6-7]。多种类型肺炎对ATⅡ存在影响，其表现的共同特点为ATⅡ出现肥大、增生，而增生的主要目是为修复上皮细胞。增生后的AT II 通过分泌细胞因子、炎症介质参与炎性细胞间的相互作用，达到抗炎、促进肺损伤修复的作用。研究发现，ATⅡ具有复杂的免疫功能，它一方面能直接合成多种免疫调节物质，如补体C2、C3、C4、C5和白介素-3等；另一方面，其合成的重要产物肺表面活性物质蛋白-A可与细菌表面脂多糖（LPS）中脂质A结合，起到活化型配基的作用，调节肺泡巨噬细胞的各种功能，增加对微生物的吞噬作用[8-9]。因而，针对AT II进行靶向干预治疗，开展免疫功能调节，对于维持患者呼吸道正常炎症反应的平衡将发挥积极和重要的作用。

噬菌体展示技术基本原理是将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中，使外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体表面，改造后的噬菌体仍然可以侵染细菌宿主。由一定长度的随机肽段混合组成的噬菌体随机肽库，理论上包含了该长度所有可能的氨基酸排列信息。将噬菌体随机肽库加入到固定有特定的靶分子的体系中，如果展示在噬菌体表面的多肽能够与靶分子发生有效的识别与结合，那么该噬菌体颗粒将被附着在受体的表面，从而与大量不存在结合的噬菌体相分离。通过几轮生物淘洗后，就能高效、快速、简便地从噬菌体随机肽库中筛选得到特异性的结合肽。近年来，噬菌体展示文库技术的筛选模式得到了不断的发展，除了传统的固相筛选之外，利用完整的细胞以及特定的组织和器官作为靶标的筛选方法都陆续得到完善。由于细胞是一个复杂的生物体系，表面分布着大量的信号分子，可反映细胞的特性及所处的功能状态，因此不同状态和种类的细胞表面会存在着数量或/和结构上具有差异的分子。相对于固相包被的方法，完整细胞筛选不需事先知道有关受体的信息，可保持细胞表面表达受体的完整构象和生物学活性，能充分模拟自然条件下蛋白质分子间的相互作用。目前，噬菌体展示技术在蛋白质相互作用及结构分析、噬菌体肽库抗体筛选、抗原模拟表位的筛选、分子疫苗的研制、疾病的诊断和治疗以及新药物的筛选和开发等研究领域都得到了广泛的应用，尤其在靶向治疗研究方面。已有多篇文献报道，利用噬菌体展示或其衍生技术发现的靶向肽配体，应用于肿瘤的影像诊断、血管和基因靶向干预，以及风湿性关节炎等其他疾病的治疗中[10-13]，并显示良好的应用前景。

本研究采用全细胞筛选的方式，利用噬菌体随机肽库对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞进行了4轮筛选，并采用PC-3细胞进行了1轮差减筛选，获得了与A549细胞存在特异性结合的多肽，利用增强绿色荧光标记和荧光显微观察技术对多肽的靶向性进行了初步验证。下一步，我们将采用更多的上皮细胞系并结合体内验证实验对多肽的靶向性进行更广泛和深入的研究，为未来急性肺损伤等呼吸系统疾病的靶向治疗药物开发奠定重要的基础。

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Screening and verification of peptides specifically targeting human type II cell alveolar epithelial A549 cells

Liu Yun, Qiu Miaojuan, Qiu Boqin, Li Jinmei.
Department of Pathophysiology Southern Medical University, Key Laboratory of Proteome of Guangdong Provence, Key Laboratory of Transcriptome and Proteome of Major Diseases of Ministry of Education, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective: Phage random peptide library was screened to for the purpose of indentifying specific binding peptides of human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells, in order to provide experimental basis for targeting intervention to alveolar type II epithelial cells, and to develop drug carrier for respiratory disease such as acute lung injury. Methods: With whole cell model, four rounds of screening with the human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells and differential screening with human prostate epithelial PC-3 cells were carried out to acquire human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells specifically binding peptides from the phage random peptide library. Among them, the highly abundant one was chosen and referred as NTG to construct prokaryotic expression vector fused with enhanced green fluorescent protein (EGFP). After transforming competent cells chromatography purified recombinant protein his-NTG- EGFP and its molecular mass was measured. The medium containing recombinant protein his-NTG-EGFP or his-EGFP was added to A549 cells and PC-3 respectively for fluorescence microscopy. Results: From the 1st to the 4th round, the phage recovery gradually increased. After PC-3 cell differential screening, a small amount of A549 cells specifically binding peptides were harvested. After recombinant expression and purification, as expected, the molecular weight of his-NTG-EGFP was determined as 33 kD. Under fluorescence microscope, as green fluorescence appeared on the surface of A549 cell treated with his-NTG-EGFP, but not on the surface of PC-3 cells incubated with his-NTG-EGFP, or PC-3 cells and A549 cells that were cultured with control protein his-EGFP, it suggested that the fused protein could bind specifically to A549 cells. Conclusions: Human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells specifically targeting peptide is acquired successfully.

Alveolar type II epithelial cellsAcute lung injuryTargeting peptidesPhage display screening

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04. 005

国家自然科学基金青年项目（81100008）；南方医科大学科研启动计划（B1012008）；广东省医学科学技术研究基金面上项目（A2013354）

（2015-08-25）