以树突状细胞为靶点的脓毒症免疫调节治疗的研究进展

DOI: 10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 02. 018

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81000848）;首都卫生发展科研专项资助项目（首发2011-5002-01,首发2011-5002-02）

通讯作者：陆江阳,主任医师(E-mail：lujy@263.net)

脓毒症（sepsis）发病机制十分复杂，一直缺少治疗的明确靶点，使之成为危重病急救医学领域的难点问题。机体免疫功能抑制是脓毒症发病的重要机制。树突状细胞（dendritic cells, DCs）损伤与脓毒症免疫功能抑制密切相关 [1-2]。近年来，以DCs为靶点的免疫调节治疗研究为脓毒症救治开辟了新的思路和方向。本文中对相关研究的新进展综述如下。

1　脓毒症免疫病理学机制与DCs

1.1　脓毒症免疫病理学机制　　创伤、休克、感染等原因引发的脓毒症是危重症医学领域中致死的一个主要原因，具有高发病率、高病死率、救治难度大的特点，一直是世界危重病急救医学领域的棘手问题。脓毒症发病机制十分复杂。自20世纪70年代以来的30多年中，过度炎症反应一直被认为贯穿于脓毒症发病的始终，但基于失控性炎症反应学说的实验性抗炎治疗却未改善脓毒症的预后和降低病死率，甚至是以失败告终。目前普遍认为，机体为清除致病原而在脓毒症早期分泌大量TNF-α和IL-1b等促炎因子，诱导强烈的全身性炎症反应（systemic inflammatory response syndrome, SIRS），继而发生代偿性抗炎反　应（compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS），机体为清除脓毒症的致病原而发生的强烈炎症反应，将通过内在机制减轻这种过高的炎症反应状态，而这种非正常的反向调节所形成的抗炎状态/免疫抑制将会引发多种免疫功能障碍，形成无法避免的持续感染，最终导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）和器官衰竭而死亡 [3]。

1.2　DCs　DCs是机体唯一能激活初始型T淋巴细胞的一种功能强大的专职性抗原提呈细胞，是T细胞免疫应答的主要启动者，在调控免疫应答或免疫耐受中起关键作用 [4]。DCs起源于骨髓造血干细胞，进而由血液循环广泛分布于机体外周组织器官，不同DCs亚群分化过程均有特定的信号通路参与调控。DCs对机体免疫反应的监控和调节是一个复杂的动态过程，包括自身成熟、提呈抗原、产生细胞因子（IL-10、1L-12、TNF-α等）、体内趋化迁移及诱导T细胞特异性免疫应答，这一系列过程将激活天然性免疫应答，诱导胸腺清除自身反应性T 细胞，分化调节性T 细胞，启动持久的适应性免疫应答，进而决定机体免疫反应的类型和强弱 [5]。近年来，随着关于脓毒症动物模型和临床病例相关研究的不断深入，DCs在脓毒症免疫紊乱中的变化和作用备受关注。

2　脓毒症免疫紊乱中DCs的变化和作用

2.1　DCs数量减少　动物模型和临床研究显示，脓毒症时淋巴或非淋巴器官中DCs出现耗竭，数量减少。在盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型的12 h、24 h和36 h，脾脏和淋巴结CD11c +DCs数量较假手术组明显减少，DCs数量减少伴随着免疫紊乱的发生，可能参与了脓毒症的免疫抑制过程 [4]。临床也观察到脓毒症患者的外周脏器间质DCs数量较未发生脓毒症的外伤患者显著下降 [6]。凋亡是DCs数量减少的主要原因。脓毒症时大量DCs发生凋亡，导致成熟活化的DCs数量明显减少，必将影响DCs抗原提呈和刺激T淋巴细胞增殖活化的免疫功能，进而引发特异性免疫应答障碍，出现免疫抑制状态 [2]。作为机体天然性和适应性免疫应答反应的重要桥梁，DCs的耗竭将会使机体的免疫应答发生紊乱。DCs数量减少与脓毒症的不良预后密切相关 [2]。在感染引发的脓毒症患者中，存活者的外周血DCs数量明显高于最后死亡者;同时，外周血DCs数量也与患者的阳性症状量表（SAPSⅡ）的评分值具有显著的相关性 [6]。因此，保存DCs的数量可以成为一种提高脓毒症生存率的治疗方法。

2.2　DCs亚群的变化　脓毒症时DCs发生了凋亡和耗竭，而不同DCs亚群也发生了具有特征性的变化 [2]。对CLP模型的研究发现，假手术组脾脏CD4 +CD8 -DCs亚群占72%，CD4 -CD8 +和CD4 -CD8 -DCs亚群分别占11%和15%；CLP 36 h模型动物组的脾脏DCs各亚群比例发生了明显变化，CD4 +CD8 -和CD4 -CD8 +DCs亚群比例分别降至49%和2%，而CD4 -CD8 -DCs亚群比例升高至47%，而且CD4 +CD8 -和CD4 -CD8 +DCs亚群的绝对数量明显下降，但CD4 -CD8 -DCs亚群的数量无显著变化，显示脓毒症主要导致脾脏CD4 +CD8 -和CD4 -CD8 +DCs亚群的选择性耗竭 [7]。根据组织分布特点，淋巴器官中DCs分为具有活化B细胞功能的滤泡状DCs（FDCs）和具有活化T细胞功能的指状IDCs。临床研究证实，脓毒症患者脾脏FDCs和IDCs都发生了明显的减少。CLP模型小鼠淋巴结FDCs和IDCs也发生了大量凋亡，二者在数量上的变化相同 [8]。

2.3　DCs免疫功能的变化　DCs对机体免疫反应的监控和调节是一个复杂的动态过程，包括自身成熟（高表达MHC类分子和共刺激分子CD80、CD86、CD40）、提呈抗原、产生细胞因子（IL-10、1L-12、TNF-α）及诱导T细胞特异性免疫应答等。临床研究发现，单个核细胞的人白细胞DR抗原（HLA-DR）分子表达水平在严重脓毒症早期显著下降，死于脓毒症的患者7 d后再次明显下降或持续维持在低水平状态 [9]。在创伤失血脓毒症模型中，脾脏DCs低表达主要组织相容性复合体-Ⅱ（MHC-Ⅱ），而CD80 和CD86的表达水平并无显著变化 [10]。利用多种脓毒症模型的研究中发现， DCs的IL-12表达水平在多个组织器官中均出现明显下降，脓毒症早期产生的抑炎因子前列腺素E 2（PGE 2）、IL-10及转化生长因子-b（TGF-b）是抑制DCs产生IL-12的重要原因。IL-12下调和IL-10上调会促进Th细胞向Th2极化，抑制Th1极化，是导致脓毒症免疫抑制的重要原因之一。DCs分泌的TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4等其他细胞因子水平也在脓毒症时发生变化，表现为TNF-α、IFN-γ和IL-6产生减少 [2]。利用创伤失血脓毒症模型的研究显示，DCs虽然也高表达共刺激分子，但其激活T细胞免疫反应的能力仍然较对照组DCs低下 [10]。

3　以DC为靶点的脓毒症免疫调节治疗

3.1　DCs体内扩增　在脓毒症过度炎症影响下，DCs数量显著减少，外周血单核细胞向DCs分化不足，天然性与特异性免疫之间的动态平衡破坏，明显减弱了DCs诱导清除病原体感染的免疫清除能力和对局部天然免疫应答的激活，是产生脓毒症后期机会感染和肿瘤发生的重要原因。利用免疫球蛋白样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）在体内刺激小鼠和人骨髓造血祖细胞的增殖和分化，补充脓毒症时DCs的减少和耗竭，可起到免疫治疗作用，能够显著提高脓毒症小鼠并发感染后的存活率，逆转体内发生的内毒素免疫耐受 [11]。在脓毒症休克模型研究中，Flt3L 补充治疗虽然不能提高脾脏中能够产生IL-12和TNF-α的DCs比例，但提高了IL-12和TNF-α的总量，明显提高了DCs的绝对数量，在一定程度上增强了DCs的免疫功能，提高了脓毒症的存活率 [11]。Toliver-Kinsky等 [12]通过Flt3L体内扩增DCs的方法降低了烧伤性脓毒症模型的伤口感染及死亡率。后续研究进一步表明，Flt3L对DCs的体内扩增作用能通过提高机体局部和全身特异性免疫应答功能，有效预防烧伤脓毒症机会感染的发生 [13]。笔者利用Flt3L在体内扩增肺DCs，可以明显减轻严重脓毒症伴发多器官衰竭模型的肺组织损伤，改善脏器功能，降低实验动物死亡率，起到了免疫调节治疗作用 [14]。

3.2　DCs输注　正常生理情况下，由多种前体细胞分化成为DCs是一个缓慢的过程。因此，输注初始型DCs（即未受到脓毒症过程损伤）补充脓毒症DCs的减少和耗竭将会达到免疫调节治疗的效果。利用小鼠脓毒症动物模型的研究显示，补充更新肺DCs可以有效改善脓毒症后期免疫抑制，减轻肺部继发性感染的范围和程度 [15]。Benjamin 等 [16]的研究亦表明，将来源于非脓毒症小鼠的DCs输注至脓毒症小鼠体内，能有效减轻脓毒症肺曲霉菌感染。向CLP脓毒症模型动物肺内输注初始型骨髓DCs（BMDCs）和脓毒症BMDCs，结果显示初始型BMDCs可以明显抑制脓毒症后期的肺真菌感染，而输注脓毒症BMDCs未见到上述治疗效果。DCs数量减少是脓毒症后期免疫抑制的重要原因，与脓毒症预后关系密切。向CLP脓毒症模型小鼠体内输注同种异体骨髓DCs，结果发现，Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12p70水平升高，Th2型细胞因子IL-6、IL-10水平显著降低，抑制性T细胞分化减少，CD4 +CD25 +Foxp3 +Tregs的增殖降低，显示此方法可有效减轻脓毒症免疫抑制，显著提高脓毒症动物生存率 [17]。目前还不清楚输注的初始型DCs是否能够重新分布到脓毒症机体，并永久改善脓毒症的免疫抑制。这些研究进一步表明脓毒症不仅导致机体DCs数量减少，同时也明显改变了体内DCs的免疫应答功能，形成免疫耐受状态，这是造成免疫抑制的重要原因之一，但这些耐受性DCs可能对脓毒症早期的过度炎症反应具有抑制或潜在的治疗作用，这还需进一步深入研究 [18]。

3.3　抗DCs凋亡　DCs凋亡在脓毒症的发病机制中占有重要的地位。DCs大量凋亡必将影响抗原提呈和刺激T淋巴细胞增殖活化的免疫功能，也可以进一步诱导淋巴细胞凋亡，引发特异性免疫应答障碍，出现免疫抑制状态 [19]。因此，抑制DCs凋亡，改善机体免疫功能，将会提高脓毒症的生存率。TNF家族不仅可以调节细胞凋亡，而且可以促进细胞增殖和活化。TNF受体家族可以通过调节Bcl-2 和Bcl-2相关蛋白质的表达来调节细胞凋亡。Gautier等 [20]研究显示，TNF家族的新凋亡诱导配体TRANCE可以抑制鼠骨髓起源的DCs和人类单核细胞起源的DCs的凋亡，上调Bcl-xL的表达，加强DCs存活。CD40L下调B细胞中抗凋亡分子Bcl-xL的表达，抑制Ig介导的细胞凋亡。而且，CD40L下调人类CD34 +祖细胞起源的DCs中Bcl-2表达，抑制Fas介导的细胞凋亡。通过TRANCE、CD40L调节DCs的凋亡而抑制脓毒症反应，相对改善了脓毒症时机体的免疫功能 [20]。本课题组的研究显示抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可以减轻酵母多糖诱导的严重脓毒症模型小鼠肺DCs过度活化导致的细胞凋亡，对肺DCs损伤具有保护作用，减轻了肺损伤，降低了实验动物的死亡率 [21]。

3.4　调控DCs分化　机体发生脓毒症时DCs分化过程出现障碍，表现为骨髓DCs前体细胞减少，同时分化为外周DCs的功能出现异常 [22]。单核细胞向DCs分化过程中发生的表观遗传学变化，可能是脓毒症后期免疫功能紊乱的重要遗传学特征，这些分化异常的DCs诱导T细胞的分化和功能也出现异常，这是机体免疫抑制产生的另一个重要原因 [23]。相关研究显示，实验性脓毒症发作6周后仍然能检测出组蛋白H3K4甲基化，组蛋白甲基化是影响脓毒症后DCs分泌IL-12下降的遗传学因素，通过去甲基化可能会调控DCs分化及IL-12的分泌，达到治疗脓毒症的效果。移植骨髓源性调节性DCs（DCregs）也能在脓毒症休克模型中起到显著的治疗作用。这些DCregs由骨髓细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-10和TGF-b联合培养8 d，然后经LPS刺激2 d，注入腹腔后可以降低内毒素休克的致死率，而且DCregs与LPS之间呈现明显的量效关系。DCregs降低脓毒性休克死亡率的保护效应可能是抑制炎症部位巨噬细胞活化、抑制淋巴细胞凋亡和抑制IL-10释放引起的CD4 +T淋巴细胞的免疫功能低下所产生的 [18]。从表观遗传学方面调控DCs分化治疗脓毒症的研究刚刚开始，即使这些治疗是有效的，但具体的靶点仍不十分清楚，因为除了DCs受到调控外，骨髓支持细胞和间质细胞同样也参与了DCs的分化和成熟过程。

3.5　DCs功能修饰　DCs分泌细胞因子和活化淋巴细胞的功能受损是脓毒症免疫抑制的另一个重要表现。因此，调节和修饰DCs功能是改善脓毒症免疫功能的又一治疗策略 [11]。国内学者在实验中发现，在严重脓毒症早期使用卡巴胆碱干预后，脾脏DCs 表面分子MHC-Ⅱ和CD86 表达降低，IL-12p70 分泌降低，显示早期抑制DCs活化，可减弱炎症反应，防止脓毒症的发生 [24]。研究表明，CLP模型小鼠经过体外转染表达IL-10的DCs预处理后，死亡率明显下降；关于腺病毒转染IL-10的DCs对脓毒症小鼠的保护效应，一种解释是可能这种DCs向T细胞提呈抗原的功能低下，抑制了过度活化诱导的CD4 +T细胞凋亡效应，另一种解释是表达IL-10的DCs与静息T淋巴细胞的相互作用诱导一种不同于Th1和Th2的T细胞亚群的分化，它们不能有效地调节炎症反应过程 [25]。炎症因子高迁移率族蛋白1（HMGB1）的过度分泌是脓毒症发生器官损伤及衰竭死亡的一个重要原因，通过siRNA干扰DCs的HMGB1分泌，修饰DCs的免疫功能，明显降低了脓毒症模型动物的死亡率 [26]。

4　结语

脓毒症免疫功能紊乱机制复杂，DCs数量减少及功能紊乱是脓毒症免疫抑制的重要原因。近年来，以DCs为靶点的免疫调节治疗研究为脓毒症救治开辟了新的途径和方向，目前研究仍停留在动物模型研究层面上，真正应用到临床依然有较多问题尚待解决。更重要的是，机体免疫系统的调节十分复杂，DCs的分化、成熟、迁移及与其他免疫细胞间的信息传递对脓毒症的影响并未完全探明，以DCs为靶点的治疗时机、剂量及安全性尚待进一步深入研究与评价。