通过调控表观遗传修饰以提高细胞再程序化效率的研究进展

谢欣彤 吴漫茵 林 瑶 蔡 飒 潘 宇 付小兵

（1. 深圳大学医学部，广东 深圳 518060；2. 广东省人民医院医学研究中心，广东 广州 510080；3．解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048）

机体发育过程中，干细胞通过程序性分化过程产生具有特定形态和功能的体细胞。细胞再程序化是通过外源性导入转录因子等方法，使之重新获得分化前的多能性（即去分化）或改变其特性进而转变为另一种组织细胞（即转分化）[1]。通过转染4种转录因子（Oc t4、Sox 2、c-My c和Klf4，OSKM），可诱导成纤维细胞再程序化为具有胚胎干细胞特性的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）[2]。Kim等[3-4]通过导入特定细胞分化所需的关键因子直接诱导成纤维细胞再程序化为神经、心肌等细胞。细胞再程序化技术日渐成为获得各种体细胞的重要途径。然而，目前细胞再程序化技术效率还很低下，这可能与再程序化发生过程中表观遗传学调控所致的细胞分化命运的随机性有关。细胞分化过程中，表观遗传学调控使染色质变得致密，多能性因子的表达位点被封闭；而再程序化使染色质重构为疏松状态，重新暴露多能因子的结合位点，这些位点的利用效率决定再程序化的效率。事实上在诱导过程中所生成的部分再程序化的前iPSCs（pre-iPSCs）的数量远高于完全再程序化的细胞数量（如iPSCs）。Pre-iPSCs无多向分化潜能，不表达或低表达核心多能性基因，虽然表观遗传修饰向iPSCs转变，仍保留分化状态的表观遗传修饰。能否使pre-iPSCs完成再程序化过程变为iPSCs依赖于随机的表观遗传事件。因此，探讨再程序化过程中的表观遗传修饰机制将对提高再程序化效率提供重要依据。本文将近年表观遗传修饰在再程序化过程中的研究进展，及其在提高细胞再程序化效率中的应用情况综述如下。

1 表观遗传修饰

表观遗传修饰即在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达和细胞表型产生可逆性可遗传改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，以及mic ro RNA等非编码RNA的调控等。研究表明，在再程序化过程中表观遗传修饰可重新激活内源性多能性相关基因、建立开放的染色质状态、并抑制种系特异性基因，有利于部分再程序化状态向完全再程序化状态转变，从而提高再程序化效率。

2 DNA甲基化修饰

DNA甲基化是指甲基被选择性转移至胞嘧啶的过程。对于脊椎动物，DNA甲基化主要发生的位点是胞苷磷酸鸟苷（Cp G），成簇Cp G所在区域被称为Cp G岛。许多基因启动子都包含Cp G岛，启动子Cp G岛的DNA甲基化可影响蛋白质与DNA的相互作用，导致基因沉默；而基因激活时启动子Cp G岛往往是去甲基化状态。这些过程主要受DNA甲基转移酶（Dnmt）和DNA脱甲基酶（d MTase）的调控。目前认识到，甲基化转移酶家族成员包括Dnmt l、Dnmt 2、Dnmt 3a、Dnmt 3b 和 Dnmt 3L[5]，其中 Dnmt l、Dnmt 3a、Dnmt 3b是DNA甲基化所必需的3种酶。Dnmt1维持细胞分裂过程中DNA复制时半甲基化DNA的进一步全甲基化，它以非甲基化DNA为底物，识别已甲基化的亲代链, 使相应位置的胞嘧啶甲基化。Dnmt3a、Dnmt3b参与建立重头DNA甲基化，先半甲基化DNA，继而全甲基化，其中Dnmt3a似乎是Dnmt1、Dnmt3b的共调节因子。在机体发育过程中，祖生殖细胞几乎完全地去甲基化，如受精卵最初几次卵裂时，其甲基化水平极低。而胚胎发育及干细胞分化的过程中，可以观察到大量的重新建立的甲基化。DNA甲基化促进细胞分化而使细胞的多能性逐渐减少，据此可推断，细胞再程序化过程中这种表观遗传修饰需被逆转。在再程序化的过程中，Dnmt的总体表达下调，导致多能性因子基因启动子区几乎被完全去甲基化。因此，iPSCs诱导因子启动子区的甲基化水平也成为评估再程序化诱导效果的重要指标之一。

目前研究显示，通过调控相关基因启动子区甲基化水平可有效影响再程序化过程。通过抑制Dnmt1可降低多能性转录因子Oct4、Nanog、Sox2启动子区甲基化水平，从而促进细胞再程序化效率。在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）诱导成iPSCs的过程中加入Dnmt1的抑制物5-氮杂胞苷（5-Aza）后，甲基化水平降低，再程序化效率可提高将近10倍[6]。利用siRNA干扰Dnmt1的表达, 也可明显提高再程序化效率。d MTase作用与Dnmt相反，抑制d MTase可促进DNA甲基化，因而可能阻碍细胞再程序化。Tet1（ten-eleven translocation-1）能够催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），参与DNA 去甲基化，从而维持再程序化因子Nanog的表达。Tet1敲除可导致Nanog基因启动子DNA甲基化，继而通过抑制Nanog基因表达降低iPSCs诱导效率[7]。活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（ac tivation-induced c ytidine deaminase，AID）可促进多能性基因启动子去甲基化。在鼠胚胎干细胞与人成纤维细胞融合的过程中，利用微小RNA（siRNA）抑制AID表达，DNA去甲基化减少，从而抑制Oc t4和Nanog基因的表达，导致细胞融合的再程序化效率显著下降[7]。

因此，多能性因子基因启动子区DNA甲基化水平是影响细胞再程序化的一个非常重要的表观遗传修饰因素，通过Dnmt及d MTase的调控改变相关基因启动子区甲基化状态，有利于提高再程序化的诱导效率[6-7]。

3 通过组蛋白修饰提高再程序化诱导效率

组蛋白的转录后修饰包括在酶的作用下进行甲基化、乙酰化共价修饰，是作用于染色质结构的调节。组蛋白乙酰化使染色体处于开放状态从而利于基因转录；组蛋白甲基化能抑制或激活转录，取决于甲基化作用的位点和程度。

3.1 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化位点位于核心组蛋白N末端尾部保守的赖氨酸残基，在组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的调控下进行。HAT将乙酰基转移到核心组蛋白氨基末端尾部保守的赖氨酸残基上，中和了组蛋白的正电荷，使组蛋白与带负电荷的DNA相互作用减弱，导致染色体结构变得疏松，这种松弛的结构促进了DNA 分子与各种转录调控因子的接触, 促进基因的转录过程[8]。相反，HDAC催化组蛋白上的乙酰基转移，增加了组蛋白和DNA的相互作用，染色体结构变得紧密从而抑制转录。在胚胎干细胞分化早期，可见广泛的组织特异性基因组蛋白乙酰化水平增高，引起组织特异性基因的表达上调。未分化细胞的多能性基因（Oc t4、 Nanog、 Rex 3等）的组蛋白处于高水平乙酰化，而已分化细胞多能性基因的组蛋白乙酰化却处于很低水平。再程序化是体细胞重获多能性的过程，因此体细胞再程序化过程中增强组蛋白乙酰化能使加入的多能性转录因子与DNA分子更充分的接触，有利于多能性基因表达上调，有利于体细胞再程序化。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂可增加组蛋白乙酰化。丙戊酸（VPA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，联合OSKM因子诱导MEFs时，可显著地把iPSCs的诱导效率提高超过100倍。在没有c-Myc诱导的情况下，VPA联合Oc t4、Sox2、Klf4因子诱导MEFs能显著地把iPSCs的诱导效率提高50倍，甚至高于仅用OSKM 4因子的诱导效率[6]。其机制可能与VPA上调了胚胎干细胞特异性基因的表达有关。例如，Rex3和Zfp7基因在未分化的胚胎干细胞中表达，在未转染的MEFs细胞中不表达，使用VPA处理已转染的MEFs，Rex 3 、Zfp7基因表达上调超过20倍[6]。此外，VPA在仅有Oc t4、Klf4因子转导的情况下也能提高iPSCs诱导效率[9]。另外一种非特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（Na B或SB）也常被用于提高再程序化效率。NaB可增强miR302/367簇启动子中Oct4的转录活性从而提高miR302/367簇的转录水平，很大程度地促进人成纤维细胞再程序化产生iPSCs的过程[10]。3种组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA, VPA和SB中，SB能最显著地提高再程序化效率。将pre-iPSCs暴露于SB，4种再程序化因子和细胞周期相关基因的表达相关性增加，能有效地促进部分再程序化的pre-iPSCs向完全再程序化的iPSCs转变，显著提高iPSCs诱导效率[11]。因此，调控相关基因特定位点组蛋白乙酰化也有望成为促进体细胞再程序化的有效手段。

3.2 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化通常发生在组蛋白H3、H4的赖氨酸（K）和精氨酸（R）残基上，包括单甲基化、双甲基化和三甲基化，受组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT）和组蛋白脱甲基酶（histone demethylase，HDM）调控。组蛋白甲基化对基因转录活性的影响取决于甲基化的位点和甲基原子团的数量，比如H3K9、H3K 27和H3K 79位点的甲基化发挥转录抑制作用，然而H3K 4位点的甲基化则有利于激活转录。体细胞多能性相关基因的启动子区域多表现为H3K4去甲基化、H3K 27甲基化和H3K 9甲基化。胚胎干细胞无论是靠近启动子区还是基因间区域，均呈现高密度H3K4me3单价键或 H3K 4me3、H3K 27me3二价键。在再程序化过程中，处于开放染色质状态的基因被H3K 4me3或H3K 4me3、H3K27me3二价标记，沉默的基因只有H3K27me3标记。

多能干细胞的组蛋白修饰模式与胚胎干细胞相似而与体细胞相反，调控特定的组蛋白甲基化状态形成可促进部分再程序化细胞发生完全再程序化。H3K 9位点甲基化是pre-iPSCs向iPSCs转化的主要表观遗传障碍。目前报道的H3K 9转移酶主要有：Setdb1、Ehmt2（G9a）和Suv39h1/2。敲除H3K 9甲基转移酶Setdb1可促进preiPSCs进一步再程序化为iPSCs，提高iPSCs的诱导效率[12]。BIX01294是一种H3K 9甲基转移酶G9a抑制剂，可通过抑制G9a而减少H3K9me2水平。在该抑制剂的共同作用下，Oc t4和Klf4两种因子即可诱导MEFs发生再程序化[13]。另一种H3K 9甲基转移酶SUV 39h1受到抑制同样能有效地提高再程序化效率[14]。与H3K9位点相似，组蛋白H3K 27位点甲基化同样可抑制转录，降低H3K27甲基化则有利于再程序化因子表达。EZH2是一种重要的H3K 27甲基转移酶，磷酸化EZH2可使其活性受到抑制，从而降低H3K27甲基化水平，增加再程序化基因的表达，有利于提高再程序化效率[15]。然而，H3K27脱甲基酶，如Utx，可减少H3K 27甲基化水平，并通过与再程序化因子相互作用，在体细胞再程序化过程中发挥关键作用；缺少Utx则抑制再程序化中多能性基因重激活的过程，导致再程序化缺陷[16]。组蛋白上另一个与H3K27位点甲基化效果相似的位点是H3K 79。用sh RNA在再程序化早期抑制H3K 79甲基转移酶（Dot1L），可致Nanog和Lin28因子表达增加，甚至替代Klf4和c-Myc 因子的作用，促进再程序化[14]。

与以上3个位点甲基化作用相反，H3K4位点的甲基化则有利于激活转录。KDM5B是一种H3K 4的脱甲基酶，降低H3K4位点甲基化水平，因而阻碍再程序化过程，减少iPSCs的诱导效率；抑制KDM5B则可提高Pou5f1、Tbx 3等胚胎干细胞特异性基因的启动子H3K 4me3水平，从而提高iPSCs的诱导效率[17]。

4 染色质重塑对再程序化的促进作用

染色质重塑是指染色质位置和结构上发生的复杂变化过程，参与调节该过程的主要因子统称为染色质重塑复合物，主要包括染色质共价修饰复合物（histonemodifying complex，HMC）和ATP 依赖的染色质重塑酶（ATP-dependent chromatin remodeling complex，ADCRC）。HMC包括对组蛋白的尾部进行乙酰化、甲基化等共价修饰的相关酶类。ADCRC主要有三大家族：SWI/SNF、ISWI和 CHD（chromodomain helicase DNA-binding）。这些酶通过与组蛋白甲基化或乙酰化相关酶类的相互作用，利用ATP水解释放出来的能量导致染色体结构变得疏松，使得转录因子在细胞再程序化过程中对DNA/染色质有可接近性，促进基因转录。在细胞分化过程中，染色质重塑导致染色质结构逐渐变得致密。体细胞再程序化过程中，染色质紧密程度下降从而向开放的染色质状态改变，但局部的染色质重塑导致种系基因沉默及多能性相关基因激活。目前多个报道证实，通过调解ATP 依赖的染色质重塑酶可使染色质向开放状态改变从而促进再程序化的过程。

SWI/SNF家族是目前研究较多的ATP 依赖的染色质重塑酶，它在体细胞再程序化和维持干细胞多能性中有着重要的作用。从分子水平上，SWI/SNF家族由BAF组成，BAF155和BRG1协同地促进DNA在多能性相关基因Oct4、Nanog、Rex1 启动子的去甲基化，增强了再程序化因子在多能性基因启动子的结合活性，从而促进了再程序化过程[18]。ISWI的作用方式则大为不同，通过动员核小体和控制分隔核小体的连接DNA的长度，保持核小体合适的间距来调控转录，从而影响再程序化效率[19]。CHD1对于维持胚胎干细胞多能性及维持其染色质开放状态是必需的。通过调控多能基因的染色质开放程度促进再程序化。下调CHD1的表达可导致再程序化MEFs产生的iPSCs克隆的数量明显减少，再程序化效率下降[20]。因此，染色质体结构的开放程度影响再程序化过程，染色质重塑酶类可作为提高再程序化效率的重要靶点。

5 miRNA调控提高再程序化效率

非编码RNA（noncoding RNA，nc RNA），尤其是微小RNA（micro RNA, miRNA），作为一种重要的基因转录后调控因素，在再程序化过程中发挥的重要作用受到普遍关注。miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，通过沉默复合体降解靶mRNA而阻遏其表达。miRNA与细胞发育的时序调控有关，参与调控细胞发育、细胞增殖和凋亡等过程。最近，越来越多的研究表明，胚胎干细胞特异性的miRNA在维持iPSCs多能性的调节网络中扮演着重要角色，能明显提高再程序化效率[21-24]。

目前被报道较多的胚胎特异性miRNA主要有miR-302-367 簇，miR-371/290簇（miR-371存在于人的细胞中，鼠细胞中的同源是miR-290簇），以及miR-17–92 簇。在体细胞再程序化过程中，胚胎特异性miRNA能阻遏以细胞周期基因及多能性基因Oct4、 Nanog、 Sox2、 Klf4和Myc为靶向的转录抑制因子，促进多能性基因的表达及自我更新，并且能直接阻断细胞分化相关基因的表达，阻碍细胞分化的过程，促进再程序化。报道证实，miR302/367能把人类成纤维细胞高效地再程序化形成一种多能性状态，将近10%的细胞产生iPSCs克隆，比标准的OSKM因子诱导更有效率，并且不需要外源转录因子的参与[21]。此外，研究人员还通过诱导miR-302过度表达成功将人类毛囊细胞再程序化成iPSCs。目前认为，miR302可抑制4种表观遗传调节因子：AOF2 （又称KDM1或or LSD1，通过使H3K4脱甲基化抑制基因转录）、 AOF1、 MECP1/2。以上甲基化调节酶酶类受到抑制后，可导致广泛的DNA去甲基化和H3K4甲基化修饰，结果引起Oct3/4、Sox2和Nanog表达上调，这些因子又可进一步刺激miR302的表达，形成体细胞再程序化所需要的正反馈循环[22]。此外，研究还发现miR302簇的各个miRNA单独作用时对再程序化效果均有不同程度的影响，如miR367为再程序化中激活内源性Oct4所必需。miR-302a、 miR-302b和miR-200c可显著提高OSKM和Oc t4、Sox 2、Klf4诱导猪成纤维细胞的再程序化效率和缩短再程序化时间，并且发现Oct4、Sox 2、Klf4联合 miR-302a、miR-302b 和 miR-200c诱导系统的诱导效率与OSKM 4因子诱导系统差别不大，推测这3个 miRNA 可以替代c-Myc的作用[23]。其他胚胎干细胞特异性miRNA簇也可以提高再程序化效率，例如miR-29b通过靶向结合Dnmt3a 和Dnmt3b促进iPSCs形成[24]。MEFs特异性miR-291-3p、 miR-294和miR-295可代替c-My c，提高Klf4、Oct4和 Sox2诱导体细胞去分化成为多能干细胞的效率。

此外，在诱导跨细胞系直接转分化的再程序化中，miRNA也凸显出其重要价值。最近，Lu等[25]用miR-302联合表达Pdx 1、Ngn3、Maf A的质粒转染人类肝细胞，随后用培养成熟分泌胰岛素的细胞的特定化学培养系统培养，共转染增加胰腺发育相关基因（Sox 17、 Fox a2和endogenous Pdx1）的表达，最终肝细胞被诱导成β样细胞分泌胰岛素，并且能生理性地根据葡萄糖变化释放激素。因此，miRNA诱导的再程序化不仅效率较高，而且还可作为一种非病毒载体、非转录因子介导的诱导方法，为进一步提高再程序化效率的研究提供了思路。

6 结 语

越来越多的研究表明，表观遗传修饰在再程序化中扮演至关重要的角色。近年来，针对细胞分化和去分化过程中表观遗传调控机制的研究飞速进展，目前表观遗传修饰对再程序化的调控还存在缺乏特异性等问题，这都体现出目前我们对表观遗传学的认识还不够完整。因此，还需更深入解析表观修饰事件发生的顺序、识别其中作用的因子、明确不同事件和不同因子之间的关系。

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