病毒性心肌炎小鼠体内NT-proBNP的水平变化及意义

徐艳艳，范晓晨

病毒性心肌炎小鼠体内NT-proBNP的水平变化及意义

徐艳艳，范晓晨

目的探讨氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）在病毒性心肌炎（VMC）小鼠体内的水平变化及其意义。方法100只Balb／c小鼠随机分为VMC组（n＝60）和对照组（n＝40）。VMC组小鼠腹腔注射柯萨奇B3病毒（CVB3），对照组注射等量不含病毒的DMEM液。VMC模型建立后分别在第3、7、14、28天每组随机处死10只小鼠，留取血液和心脏标本。使用ELISA法检测两组小鼠血清中NT-proBNP含量，HE染色观察心肌组织病理改变。分析VMC组小鼠不同时间血清NT-proBNP含量与心肌组织病理积分的关系。结果VMC组小鼠血清NT-proBNP水平明显高于对照组（P＜0.05），且VMC组不同时间的NT-proBNP水平之间差异有统计学意义（P＜0.05）。血清NT-proBNP水平与心肌组织病理积分呈显著正相关性（r＝0.829，P＜0.05）。结论血清NT-proBNP水平可反映VMC小鼠心肌损伤的严重程度，可作为判断其危险分层的血清学指标之一。

病毒性心肌炎；小鼠；氨基末端脑利钠肽前体

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由以肠道病毒为主感染引起的心肌组织局灶性或弥漫性炎症。其临床表现多变，轻者可无症状，重者可猝死，慢性病程可演变为扩张型心肌病［1］。目前临床上尚无特异性诊疗方法。脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）是利钠肽家族中的一员。氨基末端脑利钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）是由心室肌细胞分泌的proBNP降解而成［2］。目前国内外关于NT-proBNP的研究［3-4］多集中在心功能不全、肾功能不全、急性冠脉综合征和肺部疾病等。但NT-proBNP在VMC中的研究鲜有报道。该研究以VMC模型小鼠为基础，检测其体内NT-proBNP水平的变化，探讨血清中NT-proBNP水平与VMC之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验病毒 柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）M株是由安徽医科大学基础医学院微生物教研室惠赠，并在Hep-2细胞中传代，反复冻融3次使病毒完全释放，离心取上清液分装，于-70℃冰箱保存备用。96孔板接种Hep-2细胞，待长满后加入倍比稀释后的病毒液，每个稀释度8个复孔。逐日观察4 d，显示细胞缩小，浮于维持液。病变达到（+++）判定为病变孔，依据Reed-Muench方法计算病毒的组织培养半数感染量（50%tissue culture infectious dose，TCID50）为1×10-7。

1.1.2 实验动物 清洁级雄性Balb／c小鼠100只，4周龄，于清洁级环境中饲养，重13～16 g，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 Balb／c小鼠随机分为VMC组（n＝60）和对照组（n＝40）。VMC组腹腔注射0.1 ml含1×102TCID50CVB3的DMEM液，对照组腹腔注射等量的不含CVB3的DMEM液。以后每天观察记录小鼠饮食饮水情况、活动变化、毛发色泽改变、精神状态、对外界刺激反应情况、死亡情况等。

1.2.2 标本采集 将接种当天记为第0天，于第3、7、14、28天每组随机抽取10只，摘眼球取血，4℃静置30 min，3 000 r／min离心10 min，分装，于-80℃冰箱保存备用。断颈脱臼处死，碘伏棉球消毒胸腹部3次，打开胸腔取出心脏，沿心脏长轴面切成两部分，生理盐水冲洗干净后放入10%福尔马林溶液固定。

1.2.3 主要试剂及血清NT-proBNP水平的测定

NT-proBNP酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自苏州卡尔文生物科技有限公司。取出冻存的血清，室温下放置30 min使其完全解冻；取出ELISA试剂盒，室温下平衡20 min，同时观察浓缩洗涤液有无结晶，如有则水浴加热使其溶解。按1∶20蒸馏水稀释浓缩洗涤液。取出所需酶标板条数，设置标准品孔、空白孔、样本孔。标准品孔内各加不同浓度的标准品50 μl；空白孔不加；样本孔分别加入第3、7、14、28天VMC组和对照组小鼠血清10 μl，每孔再加40 μl样本稀释液。除空白孔外，每孔加辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μl，封板膜封住，37℃恒温箱温育1 h。弃去反应孔内液体，吸水纸上拍干。每孔加满洗涤液，防止临近孔洗涤液交叉污染。静置1 min，弃去洗涤液，吸水纸上拍干，如此反复5次。每孔各加50 μl底物A、B，避光，37℃恒温箱温育15 min。每孔加50 μl终止液终止反应。将96孔板放酶标仪内，调至450 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值。根据标准品OD值制出OD值-浓度的标准曲线。计算各组小鼠血清中NT-proBNP的浓度值。

1.2.4 心肌病理学检查 心肌组织固定后石蜡包埋，3 μm厚切片。常规HE染色，光镜下观察心肌病理改变。染色结果请两位病理科医师按照Rezkalla et al［5］方法进行双盲阅片计算心肌病理（炎症细胞浸润和坏死）积分，即每张切片随机选5个高倍镜视野（×400），计算每个视野内炎症细胞浸润和坏死面积占整个视野的百分比：无病变计0分，病变＜25%计1分，25%～49%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料以表示。组间比较采用两独立样本均数t检验、完全随机设计资料或重复测量设计的方差分析，两变量间相关分析采用线性相关分析。

2 结果

2.1 一般情况VMC组小鼠第3天开始有少饮、少食、少动、耸毛、脱毛、毛色渐暗、精神萎靡、体重减轻、对外界刺激不敏感等异常情况出现并逐渐加重，第4天开始有死亡，第7～10天为死亡高峰，第13天后无小鼠死亡，并且小鼠精神状态逐渐恢复。小鼠共死亡11只，死亡率达18.33%。对照组小鼠饮食正常、活动正常、毛色光滑发亮、体重增加、对外界刺激反应敏捷，无死亡现象。

2.2 心肌组织病理变化

2.2.1 心脏大体改变 VMC组解剖显示7～14 d小鼠心脏外膜出现大小不等的白色点状、斑块状坏死灶，并且随着病变进展斑块大小相继发生改变。心外膜下可见点片状淤血斑，心肌纤维弹性变差。对照组未见异常变化。

2.2.2 心肌组织形态学改变 对照组心肌纤维结构正常，横纹清晰，未见异常。VMC组第3天显示心肌细胞肿胀，横纹模糊不清，心肌纤维扭曲，间质内有少量炎症细胞浸润。第7天可见大量炎症细胞浸润，心肌细胞大量变性、坏死融合成片，边缘亦可见核碎裂。第14天部分炎症病灶逐渐吸收，但仍处于较高水平，血管旁纤维细胞增生。第28天炎症细胞进一步减少，心肌细胞减少，纤维细胞增多，胶原纤维沉积，血管旁尤其明显，纤维走形紊乱。见图1。

2.2.3 各组小鼠心肌组织病理积分比较 采用重复测量设计的方差分析显示，VMC组各时间小鼠心肌组织病理积分比较，差异有统计学意义（F＝8.67，P＝0.001）。VMC组各时间小鼠心肌组织病理积分与对照组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 VMC组与对照组小鼠心肌组织病理积分比较（分，）

表1 VMC组与对照组小鼠心肌组织病理积分比较（分，）

时间VMC组对照组t值P值第3天1.20±0.450.00±0.006.00＜0.001第7天2.60±0.550.00±0.0010.61＜0.001第14天2.00±0.710.00±0.006.33＜0.001第28天0.80±0.450.00±0.004.000.004

2.3 VMC组和对照组小鼠血清NT-proBNP水平的比较

2.3.1 各组小鼠血清NT-proBNP浓度比较 VMC

组小鼠血清中NT-proBNP浓度在接种CVB3后第3天开始升高，第7天达到高峰，以后逐渐降低，第28天仍高于正常。采用方差分析各时间NT-proBNP浓度，差异有统计学意义（F＝78.07，P＜0.001）。各时间VMC组NT-proBNP浓度与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 VMC组和对照组小鼠血清NT-proBNP的浓度值（pg／ml，）

表2 VMC组和对照组小鼠血清NT-proBNP的浓度值（pg／ml，）

时间VMC组对照组t值P值第3天775.80±108.3087.23±5.688.49＜0.001第7天1 864.93±60.4494.75±26.4039.24＜0.001第14天1 281.24±53.28102.31±48.1128.67＜0.001第28天413.89±97.1090.51±11.344.520.006

2.3.2 VMC组各时间血清NT-proBNP浓度比较

采用方差分析显示，VMC组各时间血清NT-proBNP浓度比较差异有统计学意义（F＝260.76，P＜0.05）。

2.4 VMC组血清NT-proBNP的浓度与心肌病理积分间的相关性线性相关分析显示，VMC组小鼠第3、7、14、28天血清NT-proBNP浓度与其心肌组织病理积分间呈显著正相关性（r＝0.829，P＜0.05）。

3 讨论

Balb／c鼠对嗜心肌病毒极其敏感，且繁殖快，易饲养，因而成为国内外研究VMC首选的实验动物。本研究以4周龄、雄性Balb／c小鼠为研究对象，通过腹腔注射0.1 ml CVB3来建立VMC模型。VMC组小鼠于接种CVB3后第3天开始有出现少动、少食、精神萎靡等症状，第4天开始有小鼠死亡，第7～10天死亡7只，为死亡高峰，占全部死亡小鼠的63.63%，并且VMC组小鼠心肌组织病理证实有不同程度的炎性细胞浸润伴邻近心肌细胞的变性或坏死，表明本实验中VMC模型构建成功，为进一步分析NT-proBNP水平与VMC之间的关系奠定了基础。

BNP是目前最常被用到的利钠肽家族的核心成员，具有利尿、利钠、舒张血管、抑制交感神经、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统等生物学活性。NT-proBNP无生物活性，但半衰期是BNP的3～6倍，且稳定性好。NT-proBNP以此优势而应用于临床。

Narin et al［6］研究有扩张性心肌病病史的心脏衰竭患者的心脏超声，并检测其血清NT-proBNP，发现NT-proBNP比传统超声心动图的各种参考指数更敏感有效，并且NT-proBNP是曾有心肌炎病史患儿持续存在心功能不全的良好标志物［3］。目前，研究［7］已证实丙型肝炎病毒也是VMC的致病原，对于慢性丙型肝炎病毒感染患者，通过检测NT-proBNP可以判断患者是否出现心功能不全。本研究通过建立VMC小鼠模型来探讨疾病发展过程与血清NT-proBNP水平之间的关系，结果显示不同时期VMC组小鼠血清NT-proBNP水平均明显高于对照组。VMC小鼠在病毒感染早期（第3天），心肌组织轻度病变，但血清NT-proBNP水平与对照组相比已有明显升高；随着疾病的进展，第7天心肌组织病理改变达到最明显时，NT-proBNP水平也达到最高；其后，炎症逐渐消散，NT-proBNP也随之降低，但仍高于正常值。VMC组不同时间的NT-proBNP水平差异有统计学意义。在心肌组织病变早期，宿主尚未形成明显的免疫应答，病毒大量复制，这不仅可直接损伤被感染心肌细胞，还可通过肠道病毒蛋白酶2A的超表达来清除抗肌萎缩蛋白，导致心肌细胞骨架与外部基底膜分离，从而破坏心肌细胞的完整性，进一步导致心肌细胞收缩力降低、细胞死亡［8-9］。研究［10-11］表明，此期心肌细胞的线粒体DNA（mtDNA）缺失率增加，线粒体基因表达降低，心肌细胞能量供应不足。心脏泵血能力降低，心室内血液积聚，牵拉房室壁，刺激心肌细胞分泌NT-proBNP。随着疾病的发展，病毒以及自身免疫对心肌细胞的损伤、间质水肿、大量炎症细胞的浸润、一氧化氮及细胞因子的间接损伤使心肌组织坏死并融合，心肌收缩和松弛严重损伤，依从性降低，引起心肌收缩和舒张功能明显障碍，心输出量降到最低甚至发生心源性休克［12］。此外，在病变高峰期，参与维持细胞骨架和新陈代谢的蛋白质比例也发生很大变化［13］。同时，mtDNA缺失率在此期达到顶峰，并且mtDNA缺失率与心功能不全的程度相一致［10］。心肌的结构、功能、能量供应全部遭到破坏，血液进一步积聚，房室壁的牵拉达到顶峰，从而引起NT-proBNP的大量分泌。同时这也解释了小鼠在第7～10天死亡率达到顶峰的原因。恢复期炎症逐渐吸收，坏死灶溶解消散，用增生的成纤维细胞取代之，心肌间质增加。心肌收缩力逐渐恢复，心室依从性明显改善。mtDNA缺失率以及参与维持细胞骨架和新陈代谢的蛋白质比例都逐渐恢复。血管内皮细胞生长因子可促进血管生成、细胞分裂增殖分化。在病毒感染后，血管内皮细胞生长因子表达就逐渐增加，第14天达到高峰，以促进心脏修复［14］。因此，血清中NT-proBNP水平也随之降低，但仍高于对照组。而这正好与本研究的另一结论相一致：VMC组血清NT-proBNP浓度与心肌组织病理积分呈显著正相关性。以上阐述表明血清NT-proBNP可作为一种方便快捷、反应灵敏的判断VMC心肌损害严重程度的生化指标。

VMC的发病与机体的遗传易感性有关。对于易感者，入侵的病毒对心肌细胞的直接损伤、炎症细胞及各种细胞因子的间接损伤作用、T淋巴细胞的溶细胞作用等对心肌组织的攻击更为严重，并且病毒、炎症介质可激活体内多种转录因子使心肌细胞凋亡［15］。在病变高峰时心脏结构受到严重破坏，血液泵出大大降低，射血分数锐减，引起心脏衰竭。Sun et al［16］提出NT-proBNP是当前诊断心脏衰竭并评估其预后的生化标志物中的金标准。本研究结果显示，血清NT-proBNP水平可以反映VMC心肌损伤的严重程度，可作为判断其危险分层的血清指标之一。此外，血清NT-proBNP易于检测，可以随时掌握疾病的病情变化，进而有利于制定下一步的治疗方案。

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The changes and significance of serum NT-proBNP levels in mice with viral myocarditis

Xu Yanyan，Fan Xiaochen
（Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the changes and significance of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide（NT-proBNP）levels in mice model with viral myocarditis（VMC）.Methods100 Balb／c mice were randomly divided into VMC group（n＝60）and control group（n＝40）.Mice in VMC group were injected intraperitoneallycoxsackievirus B3（CVB3），while mice in control group were treated with the same amount of virus-free DMEM cultivate liquid.10 mice of each group were sacrificed on 3，7，14，and 28th day after VMC modeling and their blood and heart tissues were collected.The serum NT-proBNP levels in two groups of mice were detected by ELISA.Pathological changes in myocardial tissue were examined with hematoxylin and eosin stain.The relationship between serum NT-proBNP concentration and cardiac pathology score of VMC group at different time points were analyzed.ResultsThe serum NT-proBNP levels of VMC group were significantly higher than that of control group（P＜0.05）.There was a significant statistical difference between NT-proBNP levels of VMC group at different time points（P＜0.05）.The NT-proBNP level was positively correlated with myocardial histopathology scores（r＝0.829，P＜0.05）.ConclusionSerum NT-proBNP levels may reflect severity of myocardial injury in mice with VMC.NT-proBNP can be used as one of serum indicators to judge the risk stratification in mice with VMC.

viral myocarditis；mice；N-terminal pro-brain natriuretic peptide

R 725.4

A

1000-1492（2015）12-1753-05

时间：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.020.html

2015-09-08接收

安徽省卫生厅中医药科研课题（编号：2009ZY36）

安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

徐艳艳，女，硕士研究生；

范晓晨，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xcfan2000＠163.com