ApoE基因敲除高脂血症小鼠下颌下腺超微结构及上游刺激因子1表达观察

李 静，黄大可，桂 丽，贾雪梅

ApoE基因敲除高脂血症小鼠下颌下腺超微结构及上游刺激因子1表达观察

李 静1，2，黄大可3，桂 丽3，贾雪梅1

目的观察载脂蛋白E（ApoE）基因敲除高脂血症（HLP）对小鼠下颌下腺超微结构以及上游刺激因子1（USF1）表达影响。方法10只野生型小鼠予普通饲料喂养作为对照组，10只ApoE基因敲除子鼠予高脂饲料喂养作为高脂组。造模6个月后，取眼眶血检测血脂；取小鼠下颌下腺组织分别进行光镜、电镜和免疫组织化学观察。结果与对照组比较，高脂组胆固醇、三酰甘油和极低密度脂蛋白含量明显升高（P＜0.05）。HE染色观察到，高脂组小鼠下颌下腺的腺泡明显萎缩，细胞排列紊乱。电镜下，可见高脂组小鼠导管上皮内线粒体嵴断裂，腺细胞内粗面内质网囊状扩张，结构松散零乱。免疫组化显示，高脂组USF1表达下降；平均光密度值与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论HLP可导致小鼠下颌下腺超微结构出现病理改变，USF1表达减少。

高脂血症；超微结构；上游刺激因子1；下颌下腺；小鼠

高脂血症（hyperlipidaemia，HLP）是指血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）过高或血清高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）过低的一种全身代谢异常综合征。研究［1］表明，HLP是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、冠心病、高血压、糖尿病及胆石症等多种疾病的重要诱发因素。研究［2］表明，HLP可导致下颌下腺的形态结构异常及分泌功能降低。上游刺激因子1（upstream stimulatory factor，USF1）广泛参与控制和调节体内糖、脂代谢相关基因的表达。USF1作为家族联合性高脂蛋白血症（familial combined hyperlipidemia，FCHL）中第一个相关基因，可以引起患者血液中TC和（或）TG含量上升［3］。目前USF1与家族性混合型HLP以及代谢综合征的相关性是大家普遍关注的问题。尽管USF1在人体中广泛存在，但HLP时下颌下腺中USF1的表达以及超微结构的变化尚未见有关报道。载脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）敲除小鼠由于脂质代谢障碍，在病变早期迅速出现明显的HLP，是目前建立HLP较理想的典型动物模型。该实验用ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食复制HLP动物模型，对其下颌下腺进行形态学USF1表达变化的观察，以期为探讨HLP对下颌下腺形态及分泌功能的影响提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂USF1的抗体和SP免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物模型复制及标本制备10只野生型小鼠与10只ApoE基因敲除子鼠购自中国协和医科大学，清洁级，分为两组；10只野生型小鼠予普通饲料喂养作为对照组；10只ApoE基因敲除小鼠予高脂饲料（胆固醇0.5%、猪油10%、蛋黄粉10%、维持料59.5%、蔗糖20%）喂养作为高脂组；单笼饲养12周，自由摄食饮水。在此期间各组动物均不限制饮食和饮水。造模6个月后，禁食12 h将两组小鼠分别经眼眶采血送检各组TG、TC、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）水平。取下颌下腺组织，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm，进行染色处理。

1.3 HE染色切片脱蜡至水，入苏木精染色20 min，再进行盐酸乙醇分色、蓝化，入伊红染色1 min，脱水、透明、封片，显微镜观察。

1.4 电镜处理将下颌下腺组织切成3 mm大小，固定于1%锇酸，环氧树脂Epon-812包埋，超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，在日产JEO L-1230透射电镜下观察并摄片。

1.5 免疫组织化学染色采用免疫组织化学SP法染色。所用抗体及稀释度如下：一抗为兔抗鼠USF1的抗体，稀释度分别为1∶80，37℃孵育40 min后，置4℃过夜；二抗为羊抗兔IgG血清，37℃孵育15 min；辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB显色后脱水、透明和封片。用PBS替代第一抗体作阴性对照。

1.6 计算机图像分析在光镜（10×40倍）下，利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组下颌下腺HE切片中腺泡和导管图像，捕获各组免疫组化染色切片中USF1的图像，每张切片随机选取8个视野，再用metamorph生物图像软件计算各组USF1免疫阳性细胞的平均光密度（average optical density，MOD）值。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，分析各组USF1免疫阳性细胞的MOD值，数据以¯x ±s表示，两组资料比较采用t检验。

2 结果

2.1 血脂结果与对照组比较，高脂组TC、TG、 VLDL表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组小鼠TG、TC、VLDL的比较（n＝10，）

与高脂组比较：*P＜0.05

项目对照组高脂组t值TC（mmol／L）2.97±0.39*33.37±16.384.872 TG（mmol／L）1.10±0.67*5.17±2.703.940 VLDL（mmol／L）0.52±0.169.83±4.115.946

2.2 HE染色结果对照组小鼠下颌下腺由分泌部和导管部组成，分泌部为混合性腺泡。腺泡饱满，结构清晰，腺泡细胞为锥体形，胞质染色较浅，细胞核圆形且靠近基底部。导管部包括闰管、颗粒曲管（granular convoluted tubule，GCT）、纹状管和排泄管4部分组成，其中GCT是一段长而粗的弯曲小管，是啮齿类动物特有的结构。高脂组小鼠下颌下腺的腺泡出现轻度萎缩现象，细胞排列紊乱，GCT导管上皮细胞萎缩，细胞顶部胞质中嗜酸性分泌颗粒减少，结缔组织增生（图1）。

2.3 电镜结果正常小鼠下颌下腺导管上皮细胞内线粒体发达，线粒体嵴清晰完整；高脂组线粒体出现嵴断裂、紊乱、消失、基质溶解（图2）。正常小鼠下颌下腺腺细胞内粗面内质网丰富，网腔均匀且分布规则，高脂组局部粗面内质网呈囊状扩张，结构松散零乱（图3）。

2.4 免疫组化染色结果阴性对照实验结果显示为阴性。USF1阳性表达主要定位于小鼠下颌下腺

的腺泡及导管上皮细胞的细胞质和细胞核，免疫组化染色以出现棕黄色颗粒或黄色颗粒为阳性着色，对照组小鼠下颌下腺导管上皮细胞质和细胞核均出现明显的棕黄色至棕褐色颗粒，高脂组小鼠下颌下腺导管上皮细胞质和细胞核呈现浅黄色颗粒，且细胞质内着色颗粒明显减少（图4）。

2.5 计算机图像分析结果对照组小鼠下颌下腺内USF1的MOD值为（0.67±0.12），高脂组为（0.56±0.06），两者差异有统计学意义（t＝2.657，P＝0.016）。

3 讨论

HLP是由于外源性脂质摄入过多，或体内脂质代谢紊乱等各种原因导致的血浆中TC、TG和（或）LDL过高和（或）HDL过低的一种全身脂代谢异常。临床研究［4-6］证明，HLP是诱发AS和心脑血管疾病的重要危险因素，对人体健康的损害主要表现在对心血管系统的损伤。下颌下腺产生的多种生物活性物质主要通过旁分泌方式分泌到细胞间隙，直接或间接调节颌下腺的分泌活动，进而调节机体多种生理功能。本实验中ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食6个月后，其血中TC、TG明显升高，提示HLP小鼠动物模型造模成功。

本实验电镜结果表明，高脂组小鼠下颌下腺导管上皮细胞线粒体嵴断裂，腺上皮内部分粗面内质网囊状扩张，提示HLP可以导致下颌下腺超微结构的改变。细胞生命活动所需要能量和蛋白质绝大部分由线粒体和粗面内质网提供，两者形态结构和数量的变化均受细胞内外环境影响；同时在细胞和组织发生病变或损伤时，线粒体和粗面内质网均是较敏感的反映指标。本实验观察到高脂组小鼠下颌下腺线粒体出现嵴断裂、紊乱，部分粗面内质网呈囊状扩张等形态结构改变势必影响其分泌和合成功能。这可能由于HLP时持续升高的TG和游离脂肪酸易造成机体胰岛素抵抗，使葡萄糖氧化减少，无氧酵解增加，导致葡萄糖等能量代谢障碍［7-8］。

ApoE基因作为血浆脂蛋白的重要成分，是机体内重要的胆固醇载体，同时也是HLP、AS等疾病发生、发展的重要分子靶标。本实验结果显示，ApoE基因敲除高脂组小鼠下颌下腺中USF1的表达明显下降，可以推测出ApoE基因敲除和高脂饮食对小鼠下颌下腺中USF1表达具有下调作用。

USF1是真核生物体内广泛分布的一种多功能蛋白质，在机体的生长发育、免疫应答和炎症反应等方面发挥着重要的作用。近年来，大量的细胞生化分子实验研究表明：USF广泛参与控制和调节糖、脂代谢相关基因的表达［9］。Putt et al［10］从USF基因的单核苷酸多态性方面研究，发现USF基因的某些多态性的变化会出现相应个体患FCHL的几率上升，同时在易患个体中，ApoE的表达量明显下降；Lee et al［11］研究荷兰患FCHL的家庭成员发现USF的基因多态性与个体TG及ApoE的血清水平具有显著关联。本实验结果显示，高脂组小鼠下颌下腺中USF1的表达明显下降。推测ApoE基因敲除和高脂饮食对小鼠下颌下腺中USF1表达具有下调作用；而USF1的分泌减少将影响血脂代谢水平。其可能机制有：①HLP时大量脂肪细胞产生，肿瘤坏死因子-α［12］、瘦素［13］等细胞因子的高表达在胰岛素抵抗发展过程中起着重要作用，使葡萄糖代谢障碍，导致机体合成USF1所需能量不足；②HLP时，血液中血脂浓度长期处于较高水平，内皮型一氧化氮合酶的表达下调使一氧化氮合成减少，进而影响血管舒张功能和血管内皮功能导致下颌下腺血供下降［14］，引起组织缺血低氧，导致USF1的合成下降。

下颌下腺是具有内、外分泌功能的腺体，其对机体各种生理功能的重要调节作用日渐受到人们的普遍关注和重视。本实验通过建立HLP小鼠模型观察到HLP可导致下颌下腺超微结构病理改变，USF1表达减少。但是关于HLP导致小鼠下颌下腺导管上皮USF1表达下调的分子机制等问题还有待进一步研究。

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Observation of submandibular gland ultrastructure and upstream stimulatory factor 1 expression in hyperlipidemic ApoE knockout mice

Li Jing1，2，Huang Dake3，Gui Li3，et al
（1Histology and Embryology Teaching and Research Section，3Comprehensive Laboratory，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Library and Information Center，Anhui Medical College，Hefei 230601）

ObjectiveTo observe the expression of apolipoprotein E（ApoE）gene knocking out hyperlipidemia（HLP）in mice submandibular gland ultrastructure and upstream stimulating factor 1（USF1）.MethodsTake 10 wild mice fed with normal feed as control group，10 ApoE knockout mice fed with high fat as hyperlipidemia group.Six months after the model was set up，blood fat in orbital blood was tested.The submandibular gland tissues of the mice were observed by using light microscopy，electron microscopy and immunohistochemistry staining.ResultsCompared with the control group，the cholesterol，triglycerides and very low-density lipoprotein of high-fat group were significantly higher（P＜0.05）.HE staining was observed，the acini of the submandibular glands in hyperlipidemia group was atrophied obviously，and the cells were in disorder.Under electron microscopy，the submandibular gland cell mitochondria crests of mice in hyperlipidemia group were fractured，and rough endoplasmic reticulum cystically expanded，which was loose and messy.ImmunohistochemicalResultsshowed that the USF1 expression in hyperlipidemia group decreased；the difference in average optical density value and the control group was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHLP can result in pathological changes in the mouse submandibular gland ultrastructure and reduction in USF1 expression.

hyperlipidemia；ultrastructure；upstream stimulatory factor 1；submandibular gland；mice

R 332

A

1000-1492（2015）12-1725-04

时间：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.008.html

2015-07-01接收

安徽省教育厅自然科学基金研究项目（编号：KJ2012A164）

安徽医科大学1组织学与胚胎学教研室、3综合实验室，合肥 230032

2安徽医学高等专科学校图文信息中心，合肥 230601

李 静，女，馆员，硕士研究生；

贾雪梅，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：jiaxueme＠126.com