FSCN1与钌配合物在抗胃癌中的作用及相关性研究

张 敏，徐元宏，董兵斌，卢 敏，陈 鹤

FSCN1与钌配合物在抗胃癌中的作用及相关性研究

张 敏1，徐元宏1，董兵斌2，卢 敏1，陈 鹤1

目的探讨FSCN1在胃癌增殖中的作用，并研究FSCN1与钌配合物在胃癌中的相互作用。方法通过荧光定量PCR及Western blot法检测胃癌组织中FSCN1的表达水平；MTT、EdU法检测干扰FSCN1后细胞增殖能力变化；用钌配合物处理SGC-7901后检测FSCN1 mRNA、蛋白表达水平及细胞的增殖能力；siRNA抑制FSCN1的表达，过表达FSCN1后检测钌配合物对细胞的增殖能力影响。结果荧光定量PCR及Western blot法均显示胃癌组织中FSCN1表达水平显著高于癌旁组织；MTT与EdU法结果显示，与siNC组比较，干扰FSCN1后细胞的增殖受到明显抑制（P＜0.01）；钌配合物处理SGC-7901后，定量PCR结果显示，与siNC组比较，FSCN1表达水平受到抑制（P＜0.01），MTT法结果显示，与siNC组比较，细胞增殖受到抑制（P＜0.01）；MMT法结果显示过表达FSCN1后抑制钌配合物对细胞增殖能力的影响。结论FSCN1具有促进胃癌细胞增殖的能力，钌配合物通过抑制FSCN1的表达起抑癌作用。

FSCN1；胃癌；钌配合物；SGC-7901

胃癌是目前全球常见的人类消化道恶性肿瘤之一，其分子机制仍未被完全解释清楚。因此明确胃癌的发生、发展和转移的分子机制对于提高胃癌的诊断、治疗及预后都有重要的意义。Fascin-1（FSCN1）是相对分子量为55 ku的细胞骨架蛋白，其能通过聚合肌动蛋白催化其成束而改变细胞骨架，使细胞膜表面突起增多，从而增加上皮细胞的运动性［1］。在人体正常组织中FSCN1表达相对较少，而在多种肿瘤组织中均呈高表达［2-3］。FSCN1蛋白在胃癌中表达高于癌旁组织（距离癌组织＞2 cm），FSCN1的表达量与胃癌体积、侵袭程度、淋巴转移和TNM分型呈正相关性［4-5］。已有大量文献［2-5］报道FSCN1对肿瘤转移机制的影响，但对肿瘤增殖的作用机制研究未见报道。该研究检测了胃癌组织中FSCN1 mRNA及其蛋白的表达水平，探讨FSCN1在胃癌增殖中的作用，并研究FSCN1与钌配合物在胃癌中的相互作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及组织来源人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。从安徽医科大学第一附属医院收集20例胃癌组织及其配对的癌旁组织（距离癌组织＞2 cm）。所有样品液氮冷冻后存放于-80℃冰箱。该研究获得患者及其家属知情同意和安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂及仪器TRIzol、Lipofectamine®

2000、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、青霉素／链霉素购自美国Life Technologies公司；FSCN1抗体（MAB3582）和PVDF膜购自德国Millipore公司；Ligation high Ver.2反转录试剂购自日本东洋纺公司；siRNA、MTT购自美国Sigma公司；定量试剂购自美国KAPA公司；Cell-LightTMEdU Apollo®488 In Vitro Imaging Kit购自广州锐博公司；PMSF、BCA蛋白定量试剂购自上海碧云天公司；Cocktail Protease Inhibitor购自美国Roche公司；PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GC Buffer、EcoRⅠ、BamHⅠ购自日本TaKaRa公司；引物由上海英俊公司合成。Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System、NanoDrop 2000购自美国Thermo Scientific公司；Odyssey蛋白印迹成像系统购自中国LI-COR公司；DMI3000 B型倒置荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染 SGC-7901用含10%FBS和1%青霉素／链霉素的RPMI-1640在37℃、5%CO2的条件下进行培养。使用Lipofectamine®2000转染siRNA、FSCN1过表达质粒，具体操作参考说明书。6孔板中每孔siRNA终浓度为50 nmol／L，质粒每孔为4 μg。转染siNC为siNC组，转染siFSCN1为siFSCN1组，转染过表达空载质粒为NC组，转染FSCN1过表达质粒为FSCN1组。

1.3.2 钌配合物处理细胞 使用浓度为7.865 μmol／L的钌配合物L203进行对细胞的给药处理48 h，记为L203组。

1.3.3 Western blot法检测 用含有1×cocktail及1 mmol／L PMSF的RIPA强裂解液冰上裂解30 min提取细胞总蛋白，并用BCA试剂盒进行蛋白定量后，取60 μg总蛋白经10%SDS-PAGE电泳后，将蛋白转膜到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1 h，并用FSCN1抗体结合，PBST洗脱3遍后用带荧光标记的二抗孵育并扫膜拍照，以β-actin作为内参。

1.3.4 RNA抽提及实时定量PCR 用TRIzol试剂提取总RNA，参照逆转录试剂盒FSQ-301说明书以10 μl体系进行逆转录。将逆转录所得cDNA进行实时荧光定量。FSCN1上游引物：5’-ACAGCAGGGGACTCAG-3’，下游引物：5’-CCCACCGTCCAGTATTT-3’。18S上游引物：5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’，下游引物：5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’。反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性3 s，60℃退水30 s，扩增40个循环。数据采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.3.5 FSCN1过表达载体构建 从人cDNA中扩增出FSCN1（NM_003088.3）完整CDS区，经过EcoRⅠ／BamHⅠ酶切后，连接到pcDNA3.1（-）载体中。转化到DH5α感受态细胞中，挑选单克隆。经过PCR、酶切鉴定后进行测序。上游引物序列为：5′-TAAGAATTCCGCGCAGCGGCCTCTCGTCTAC-3′；下游引物序列为：5′-TAAGGATCCGTTAGCAGGGAGGGTTGGCAGGAGC-3′。

1.3.6 MTT实验 SGC-7901经过处理后接种1 000个／200 μl到96孔板中，每组设3个复孔。在1、3、4、5 d每孔加MTT溶液（5 mg／ml用PBS配）20 μl。继续孵育4～6 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO充分溶解，在450 nm处测定吸光度（optical density）值，计算3个重复孔的平均OD值。按以下公式计算细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率（%）＝（OD对照组-OD实验组）／OD对照组×100%。绘制不同药物浓度的细胞生长抑制率曲线，并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.7 EdU实验 将处理后的细胞用胰酶消化，按1×104个细胞／孔加入到96孔板中，待细胞完全贴壁后，每孔中加入50 μmol／L的EdU稀释液，继续培养2 h，弃反应液，PBS清洗细胞2次，用4%多聚甲醛室温固定30 min，每孔加入50 μl、2 mg／ml甘氨酸摇床孵育5 min，PBS洗3次。最后分别用Apollo®488染色反应液和Hoechst 33342染色30 min，期间用含0.5%TritonX-100的PBS洗3次。在荧光显微镜下观察结果。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行分析，所有计量资料采用形式表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，组间差异比较采用方差齐性检验，两两比较采用LSD法检验。

2 结果

2.1 FSCN1在胃癌组织中的表达相比于癌旁组织，在胃癌组织中有60%（12例）样本FSCN1 mRNA的表达水平显著增高，15%样本中FSCN1 mRNA表达水平无显著差异，25%的样本中FSCN1 mRNA表达水平降低（图1A）。随后，提取其中9例胃癌组织及相应癌旁组织的总蛋白进行Western blot法检测，与癌旁组织相比有6例样品的胃癌组织中FSCN1蛋白表达水平明显上升（图1B），差异有统计学意义。结果表明，FSCN1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。

2.2 通过siRNA下调胃癌细胞中FSCN1的表达对细胞增殖的影响FSCN1siRNA转染SGC-7901，48 h后通过Western blot法验证siFSCN1可以降低FSCN1表达水平，并且下调FSCN1后能够有效抑制胃癌细胞的增殖（图2A、2B）。EdU实验结果也得到相同的结论，转染了siNC的SGC-7901细胞均有50%以上能被EdU标记，而siFSCN1组被EdU标记的细胞均少于25%，其数值分别为（51±4.3）%、（22±2.7）%（P＝0.001 6）。相比siNC组，siFSCN1组DNA的复制活性显著降低，即细胞增殖能力显著降低（图2C）。

2.3 L203通过降低FSCN1表达水平对细胞增殖的影响按上述处理24 h后显示细胞增殖能力受到明显抑制，测得IC50为7.865 μmol／L（图3A、3B）。同时，MTT实验显示L203组相对于NC组，SGC-7901的增殖明显受到抑制（P＝0.002 8），见图3C。为了进一步证明L203是通过影响FSCN1的表达水平来发挥抑制胃癌细胞增殖作用，在L203药物处理48 h后分别用qRT-PCR和Western blot法检测FSCN1的表达水平，结果显示L203处理组FSCN1 mRNA及蛋白表达水平较NC组均降低50%以上（图3D、3E）。

2.4 过表达FSCN1对L203的抑癌作用的影响MTT结果显示SGC-7901中过表达FSCN1可以显著促进L203处理过的细胞的增殖（P＝0.003 5），但细胞增殖速度仍低于NC组（图4A）；EdU结果显示FSCN1可以显著促进L203处理过的细胞的增殖（P＝0.002 8），但细胞增殖速度仍低于NC组（图4B）。

3 讨论

FSCN1在细胞迁移、运动、黏附和细胞相互作用等方面具有重要的作用，并且FSCN1作为原癌基因在多种肿瘤细胞中通过增加肿瘤细胞的运动能力促进肿瘤的形成［3］。在胃癌组织中FSCN1蛋白表达与肿瘤增殖、侵袭、转移和TNM分型呈正相关性。研究［6］显示在胃癌细胞MKN45中敲减FSCN1的表达会抑制细胞的增殖和迁移。本研究检测了FSCN1在胃癌组织及其配对的癌旁组织中的表达水平，显示FSCN1在胃癌组织中高表达。在SGC-7901中下调FSCN1表达可抑制胃癌细胞的增殖。

化疗是目前临床治疗癌症的三大手段之一，铂类药物是目前治疗癌症的常用药物，但这些药物副作用大、容易产生耐药性等使其临床应用受限［7］。钌配合物作为一类低毒高效的金属基抗肿瘤化合物，与顺铂等相比具有更复杂的作用机制及较低的毒副作用而成为研究的热点［8］。目前钌配合物的抗癌机制研究主要集中在以下几个方面：与单个碱基作用；与蛋白和多肽作用；与DNA作用［9］。钌配合物作为当前非铂类抗癌药物的研究热点，有文献［10］报道其可以抑制胃癌细胞SGC-7901增殖。对于钌配合物与DNA及单个碱基的相互作用机制已研究比较透彻，但对于其他的靶向作用机制尚不清楚，这极大地制约了钌的临床应用［8］。本研究显示SGC-7901细胞经过钌配合物L203作用后细胞增殖能力受到抑制，IC50为7.865 μmol／L。SGC-7901经L203处理后FSCN1的mRNA和蛋白表达水平都比未加药物处理组明显降低。

通过L203处理细胞后过表达FSCN1质粒，MTT及EdU实验进一步确认FSCN1的过表达可以降低钌配合物的抑癌作用。该研究成果为确认钌配合物的蛋白作用靶点提供了依据。钌配合物的抑癌作用还需要进一步研究。

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Ru complex as tumor inhibitor by regulating FSCN1 in gastric cancer cells

Zhang Min1，Xu Yuanhong1，Dong Bingbin2，et al（1Dept of Clinical Laboratory，2Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the role of FSCN1 in the proliferation of gastric cancer and the interaction between FSCN1 and Ru complex in gastric cancer.MethodsThe expression level of FSCN1 was measured by qRTPCR and Western blot.The proliferation ability was tested using MTT and EdU assays.Then the mRNA and protein levels of FSCN1 in SGC-7901 cells were measured after treating with Ru complex.FSCN1 were transfected into cells，and the proliferation ability was tested using MTT and EdU assays after treating with Ru complex.ResultsThe expression level of FSCN1 in gastric cancer tissues was higher than that in adjacent tissues.Knockdown of FSCN1 in SGC-7901 cells inhibited cell proliferation.The proliferation ability and the expression level of FSCN1 in SGC-7901 cells were decreased after treating with Ru complex.And overexpression of FSCN1 reversed the antitumor effect of Ru complex.ConclusionFSCN1 as the oncogene can regulate gastric cancer proliferation，and Ru complex reverses the course by inhibiting FSCN1 expression.

FSCN1；gastric cancer；Ru complex；SGC-7901

R 735.2

A

1000-1492（2015）12-1744-05

时间：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.016.html

2015-09-30接收

安徽省年度重点科研计划项目（编号：1301043022）

安徽医科大学第一附属医院1检验科、2普通外科，合肥 230022

张 敏，女，副主任技师；徐元宏，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：xyhong1964＠163.com