内质网应激相关机制及其在炎症性肠病中的作用

李 凯，吴正祥

安徽医科大学附属省立医院消化内科，安徽 合肥230001

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一类胃肠道慢性免疫异常疾病，主要包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，其病因及发病机制尚不明确，近年来，许多研究认为是基因易感性人群中体内肠道菌群和肠黏膜免疫应答平衡失调及肠上皮功能障碍所引起［1］。肠内稳态失衡时，肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，损伤肠黏膜，影响IBD 发生。

1 IECs 与ERS

1.1 IECs 特点 肠上皮在维持肠道稳态方面起重要作用，其将共生菌群与宿主环境隔离开来，除了吸收营养物质外，IECs 能分泌多种激素和介质。小肠隐窝中的潘氏细胞为小肠干细胞分化提供微环境，并且分泌大量的抗菌肽物质，如溶解酵素、防御素、脂质运载蛋白等，这有利于宿主增强抗感染能力，同时参与共生菌群在肠道中定植［2］。肠上皮中的杯状细胞主要分泌大量黏液素，形成了黏蛋白层，构成了完整的肠内屏障［3］。另外，IECs 通过分泌多种细胞因子和趋化因子形成黏膜免疫系统抵御肠道菌群和毒素的侵袭，维持肠内环境稳定。黏液基因蛋白(MUC2)是杯状细胞分泌的大分子物质，是构成肠道屏障的主要物质，有实验发现［4］，MUC2-/-小鼠黏液屏障受损，肠道菌群直接同肠上皮接触，侵入结肠隐窝，形成自发性结肠炎。因此，IECs 功能障碍或数量减少时，抗菌肽物质分泌减少，肠黏液屏障被破坏，这是引起IBD 的一个重要因素。

1.2 ERS ERS 是指由于各种原因引起细胞内质网生理功能紊乱，导致蛋白质不能正确折叠的一种病理过程。内质网是合成蛋白质及贮存Ca2+的主要场所，IECs 对环境因素改变特别敏感，当处于高度无氧环境，高分子运转条件下，或暴露于微生物代谢产物和毒素等环境时，通过影响内质网中蛋白质加工、运输及Ca2+转运，使未折叠蛋白过度蓄积，而诱发ERS，导致细胞损伤［5］。

此时，机体为减轻ERS 引起的细胞损害，增强细胞对损伤的抵抗力，将启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR 指各种原因引起错误折叠及未折叠蛋白质在内质网中积蓄，致使ERS 蛋白转录增加、其他蛋白翻译减少、蛋白质降解增多的一种反应。UPR 能够促使未折叠蛋白或错误折叠蛋白正确折叠，从而维持IECs 生理功能正常。UPR 功能受损最终会影响潘氏细胞和杯状细胞的分泌功能，破坏肠内稳态平衡，产生IBD［6］。

UPR 的激活主要通过内质网腔内分子伴侣grp78和内质网上3 个跨膜感受蛋白感知ERS，分别为内质网跨膜激酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase related-like ER kinase，PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)，及它们各自下游的转录因子XBP1、AFT4、AFT6［7］。生理状态下，IRE1、PERK、ATF6 与grp78 结合处于无活性状态。应激时，未折叠蛋白增多，grp78 解离后与未折叠蛋白结合，引起IRE1、PERK、ATF6 的活化及释放。IRE1 在肠上皮中特异性表达，ERS 时，IRE1 通过激酶结构域启动磷酸化，形成二聚体，并激活内切核糖核酸酶，将XBP1 的mRNA(Xbp1u)移码剪接成为具有活性的Xbp1s，激活UPR［8］。同时，ERS 还激活调节性IRE1 依赖衰解(RIDD)作用，引起内质网相关mRNAs 选择性降解，这有利于减少内质网的转运负担，减轻ERS［9］。ATF6是一种Ⅱ型跨膜蛋白，当发生蛋白错误折叠后，ATF6首先被高尔基体上的S1P和S2P 蛋白酶水解，释放出胞质结构域中的ATF6f 或ATF6p50，它们能改变胞核的位置，从而激活UPR 靶基因，如grp78、grp94 和P58IPK［7］。PERK 属于丝/苏蛋白激酶，当产生内质网应激的时候，其通过丝氨酸磷酸化激活延长起始因子eIF2α，抑制内质网中蛋白质翻译，减少内质网腔内蛋白质合成。与此同时，ERS 相关蛋白表达却上调，这与应激蛋白mRNAs 基因上的某些特殊结构有关，如5-非编码区的上游开放阅读框架。这些特殊结构使应激相关蛋白逃避eIF2α 磷酸化后的合成抑制作用而得以优先翻译。ATF4 是上述过程的关键因子，它上调了eIF2α 磷酸化时应激蛋白mRNAs 的翻译水平。另外，ATF4 还介导氨基酸转运、抗氧化应激、谷胱甘肽的生物合成等过程［7］。

1.3 ERS 诱导的细胞凋亡 当ERS 过于剧烈，UPR不足以完全代偿缓解细胞损害，为维持内环境稳态，UPR 将激活细胞凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。细胞凋亡途径主要包括:(1)PERK-eIF2α-ATF4 诱导的细胞凋亡蛋白CHOP 合成;(2)IRE1 招募肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，与激酶凋亡信号调节激酶(ASK1)形成IRE1-TRAF2-ASK1 复合物，激活JNK 凋亡途径;(3)Bax/Bcl2 促进内质网Ca2+释放，协助细胞凋亡;(4)caspase 家族促凋亡作用，caspase 促凋亡机制尚不明确，可能是caspase-12 活化后进一步激活caspase-9、caspase-3、效应caspase 切割多ADP 聚合酶和其他细胞内底物，最终导致细胞凋亡［10-11］。细胞凋亡是ERS 过强时一种保护机制，其清除多余的受损细胞，有利于减少组织损伤。

2 ERS 与IBD 的发生

正常状态下，XBP1 处于低丰度(丰度指基因在一个基因组中的数量)，这意味着XBP1 功能仅有微小变化时，IECs 也极易产生ERS。Kaser 等［12］发现，敲除IECs Xbp1 的小鼠发生了与人类IBD 相似的回肠炎。同时，Xbp1-/-小鼠IECs grp78 表达水平增加，表明发生了ERS。最终小鼠IECs 中成熟潘氏细胞数减少，残余的潘氏细胞分泌抗菌肽物质不足，导致肠道抗菌功能受损。另一方面，杯状细胞数量也减少近30%，引起肠道黏液屏障损害。XBP1 缺陷还使JNK 磷酸化和嗜酸性粒细胞趋化因子CXCL1 分泌过多，使IECs 对微生物或细胞因子敏感性增加而产生炎症。通过病理活检发现XBP1-/-小鼠存在隐窝缺陷，中性粒细胞和单核细胞浸润及溃疡形成更能加以证实ERS 与IBD相关。

在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎实验中，野生型结肠炎小鼠发生ERS，grp78、ATF4、CHOP及XBP1 表 达 增 加［13］。与ATF6α+/-小 鼠 相 比，ATF6α-/-小鼠由于UPR 信号通路异常，使上皮细胞凋亡信号被激活，最终grp78、grp94 和P58IPK表达减少，细胞凋亡增加，表现出更严重的肠上皮黏膜损害。与同窝对照的野生型小鼠相比，P58IPK-/-小鼠grp78、IRE1 磷酸化、CHOP 水平上调，也出现更严重的黏膜损害，同时伴有杯状细胞减少，炎症浸润更深。因此，UPR 对于IECs ERS 至关重要，其通路信号受损将加重结肠炎症。

Heazlewood 等［14］用ENU 诱导两株老鼠(Winnie株和Eeyore 株)产生自发性结肠炎，结果发现两株老鼠的Muc2 基因均发生错义突变。两株老鼠的Muc2生物合成发生改变，Muc2 蛋白前体错误折叠并在内质网空泡内异常积聚，成熟Muc2 贮存减少，杯状细胞分泌黏蛋白数目也明显减少。这些超微结构和生物合成改变都说明发生了ERS。这更进一步证明错误折叠蛋白与ERS 及IBD 之间的紧密关系。

除动物模型外，在人体研究中也发现了ERS 与IBD 联系的相关证据。有学者通过实验指出活动期CD 患者肠上皮中grp78 表达和XBP1 剪接高于正常对照人群，认为这与IECs 表面的ATP 结合盒G2(ABCG2)转运蛋白错误折叠后水平下调有关［15］。另外一项研究中，与健康对照比较，UC 患者的非炎症结肠黏膜组织中XBP1 剪接、IRE1 活化大幅度增多，应激蛋白grp78、grp94 表达也均增多。结果表明，UC 的肠上皮中存在大量的ERS，其甚至可以发生于非炎症组织，而健康对照组中却未发现，说明ERS 可作为UC的一般特征［16］。

3 ERS 在IBD 中的基因学研究

基因相关研究已经发现XBP1 基因座突变导致连锁不平衡反应缺失与IBD 发生有关。在XBP1 基因深度测序实验中，IBD 患者XBP1 基因座上SNP(指在基因组上单个核苷酸的变异)大约是健康对照组的3倍，并且非同义SNP(nsSNPs)几乎只存在于IBD，健康对照组基本没有。推断XBP1 基因座是IBD 的风险位点，XBP1 基因突变增加IBD 易感性［12］。

前梯度同源蛋白2(AGR2)是一种二硫键异构酶，能促使内质网黏蛋白二硫键正确折叠。AGR2 基因变异造成蛋白错误折叠，引起ERS，黏蛋白合成减少，促进IBD 发生。IBD 患者中，AGR2 蛋白表达水平下调［17］。实验发现，AGR2-/-小鼠肠上皮发生ERS，最终发展为以肉芽肿特点为主的回肠结肠炎，其大肠炎症病理特征与人类IBD 相似［18］。

4 ERS 与固有免疫、上皮细胞自噬

固有免疫应答在IBD 发病机制中起重要作用。Richardson 等［19］在研究秀丽隐杆线虫中发现固有免疫应答能诱导ERS 发生，XBP1 能够保护机体避免免疫应答带来的损害。肠道炎症时，机体启动固有免疫应答，肠上皮中炎症细胞分泌多种炎症因子，不同程度诱导或抑制ERS。IL-10 是IBD 时重要的抗炎症因子，实验表明，与野生型小鼠比较，IL-10-/-小鼠发生慢性肠道炎症时，肠上皮中grp78 表达增多。认为IL-10 调节p38 信号通路抑制ATF6 转录，减缓ERS。相反，某些促炎症因子如TNF-α 却诱导ERS［20］。因此，炎症因子与ERS 相互作用共同影响IBD 的发生。

自噬是细胞处于应激或感染时，细胞自我吞噬引起胞内组分分解代谢过程，其最主要特点就是自噬体形成，它能通过溶酶体机制来降解其所包裹的内容物。Cadwell 等［21］报道在CD 中，自噬体基因ATG16L1 纯合子变异使潘氏细胞中形态异常的蛋白颗粒蓄积，导致蛋白颗粒分泌途径受损和高水平的炎症反应。这说明IECs 自噬过程能够维持胃肠稳态，减少IBD 易感性。

有研究认为，ERS 是自噬激活的因素，Ogata 等［22］发现，IRE1 缺陷的细胞或给予JNK 抑制剂的细胞中，ERS 诱导自噬受抑制，而PERK 缺陷的细胞或敲除ATF6 的细胞受到ERS 后仍发生自噬，表明IRE1-JNK通路是激活自噬过程的关键。另外，有证据表明CHOP、ATF4 能够上调自噬基因的转录［23］。ATG7 是参与自噬体合成的一个重要蛋白，自噬受损时，ATG7蛋白受抑制，引起ERS，ATG7 表达恢复后，ERS 减轻［24］。推测自噬与ERS 具有协同作用，UPR 时，自噬可以作为内质网相关蛋白降解过程的补充。自噬功能受损使IECs 对ERS 易感性增加，影响IBD 发生。

5 ERS 与IBD 的治疗

由于IECs 极易受ERS 的影响，导致肠内炎症，因此，若能通过减轻ERS 和改善UPR 功能来修复肠上皮功能，恢复肠内稳态，这有可能为IBD 治疗提供新的方向。Cao 等［13］在实验模型中对小分子伴侣物质牛磺去熊样胆酸(TUDCA)和4-丁酸苯酯(PBA)的功能进行研究，分别给予Atf6α-/-、P58IPK-/-、野生型3株结肠炎小鼠口服TUDCA 或PBA 其中一种，结果发现3 株老鼠IECs 中ERS 减轻，炎症均明显缓解，最后实验人员将结果与接受吡罗昔康来诱导缓解的IL-10-/-小鼠作对照，发现治疗效果基本相同。这些数据指出，小分子伴侣促进内质网中的蛋白质正确折叠，减轻ERS，由此来缓解实验诱导的肠内炎症。

谷氨酰胺是人体非必需氨基酸，有人用谷氨酰胺治疗三硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠后，小鼠结肠炎症减轻，ERS 标记物ATF6、ATF4、CHOP 表达下调，IRE1 磷酸化水平和XBP1 剪接也减少，表明谷氨酰胺能抑制ERS 和细胞凋亡［25］。目前对ERS 在IBD 中研究尚少，也没有ERS 相关药物用于IBD 临床治疗，因此，通过调控ERS 及UPR 通路治疗IBD 具有广泛的应用前景。

多个动物模型实验、人体研究及基因研究表明［12-18］，ERS 在维持胃肠稳态过程中具有重要意义。当ERS 过于剧烈或UPR 功能障碍时，将激活细胞凋亡途径，引起IECs 数目减少和功能障碍，损害肠黏膜，是人类IBD 炎症的重要原因。机体固有免疫、自噬过程与ERS 共同作用，影响IBD 发生。ERS 相关炎症机制不仅有助于理解IBD 发病基础，也为将来治疗IBD提供有效方法。

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