长链非编码RNA 在胃肠道疾病中的研究进展

朱 灵，李善高

浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江 杭州310006

1 lncRNA 概述

lncRNA 首先由Okazaki 等［1］于2002 年在对小鼠全长cDNA 文库的大规模测序中发现。起初，lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA 聚合酶Ⅱ转录的副产物，并不具有任何生物学功能。但随着人类基因组计划的完成和哺乳类转录组数据的不断积累，现认为人类和其他高级真核生物的遗传物质只有不到2%转录为蛋白质，余下超过98%转录为编码能力极低或无编码功能的ncRNA。根据转录本的大小，ncRNA 可分为长ncRNA(LncRNA)和小RNA(siRNA、miRNA、piRNA)。lncRNA 与mRNA 有着许多共同的特性，许多已知的lncRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA pol Ⅱ)转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。根据lncRNA 在基因组上相对于蛋白编码基因的位置关系，可以将其分为5 类［2］:(1)正义lncRNA:与同一条链上蛋白编码基因转录方向相同;(2)反义lncRNA:与同一条链上蛋白编码基因转录方向相反;(3)双向lncRNA:可同时向同一条链上蛋白编码基因转录方向相同或相反的方向进行转录;(4)内含子lncRNA:由转录产物的一个内含子区转录得到;(5)基因间lncRNA:由两个基因间的区域转录得到，常称为 lincRNA (large intergenic noncoding RNA)。任何一个lncRNA 都可根据其在基因组上的位置归于以上5 类中的一种，这种位置关系有助于lncRNA 功能的预测。lncRNA 不仅在多种组织中广泛表达，其功能也呈多样性。但由于lncRNA 具有数量众多、序列保守性较差、缺乏开放阅读框(open reading frame，ORF)等特点，所以，对于lncRNA 功能的探索要比microRNA 和蛋白质困难得多。目前研究认为其功能作用机制主要包括干扰下游基因表达、影响编码蛋白基因转入及调节蛋白质功能等。随着对lncRNA 研究的深入，越来越多的研究发现，与microRNA 相比，在细胞内转录比例更高的lncRNA 同样具有极其复杂且重要的生物学功能，可在多个层面上调控基因的表达，在胚胎发育、细胞分化、疾病及肿瘤的发生、发展过程中都起着重要作用。

2 lncRNA 与胃肠道疾病

2.1 lncRNA 与胃癌 HOX 转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)存在于HOX 基因中，是第一个被发现具有反式转录调控作用的lncRNA。早期已有研究报道证实lncRNA-HOTAIR 的表达增强与多种恶性肿瘤的侵袭、转移及预后相关，如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌，然而在胃癌领域的研究较少。近年来陆续有HOTAIR 在胃癌方面的研究报道，Hajjari 等［3］研究发现，胃腺癌组织中HOTAIR 转录本表达较正常胃组织上调5.285 倍，此外，HOTAIR的表达水平高低与胃腺癌TNM 分期相关，HOTAIR 异常表达机制可能与胃腺癌上皮中存在SUZ12 基因相关。Xu 等［4］不仅发现胃腺癌组织中HOTAIR 表达水平增高，还通过患者总生存时间的随访，发现高表达组患者生存时间较低表达组短，其机制可能是HOTAIR通过调控Snail 的表达使胃癌细胞由上皮组织向间叶组织转变及促使转移相关基因，如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP1)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)等表达异常来影响总生存时间;而沉默HOTAIR 表达后可以减弱癌细胞的侵袭能力及MMP1 和MMP3 表达水平，逆转胃癌的上皮间质转化。这些研究表明HOTAIR 在胃癌的发生、发展中起一定的作用，推测HOTAIR 的表达水平检测有望成为胃癌的诊断及预后预测的新指标。

lncRNA-H19 是最早发现与肿瘤相关的lncRNA，前期研究表明H19 在膀胱癌、原发性肝癌及继发性肝癌时表达均升高，近期有H19 在胃癌研究方面的报道，有学者采用组织芯片技术分析胃癌组织及正常组织中lncRNA 的表达谱变化［5］，共发现135 条lncRNA中有71 条表达上调，而64 条表达下调，其中H19 上调最明显(8.91 倍)。Yang 等［6］通过PCR、流式细胞仪、RNA 免疫沉淀法(RNA immunoprecipitation)等技术发现，H19 在胃癌组织中表达显著升高，且其异常表达可促进胃癌细胞的增殖，通过RNA 干扰法沉默H19后可导致胃癌细胞株的凋亡。进一步研究发现，H19抑制肿瘤抑癌基因P53 的激活，并且能抑制P53 依赖性靶基因Bax 的蛋白表达水平。不仅在胃癌组织中H19 表达水平上调，胃癌患者循环血浆中H19 水平也增高，Arita 等［7］通过对胃癌患者血浆中循环lncRNA的表达水平进行研究发现，胃癌患者血浆中H19 的水平显著高于健康组，且胃癌术后患者血浆中H19 的水平显著降低。以上研究显示出H19 在胃癌的检测、预后预测及治疗中潜在的应用价值。

Yang 等［8］发现在胃癌组织中lncRNA-CCAT1 表达水平较正常组织显著增加，通过染色质免疫沉淀等现代分子生物学技术，证明其机制是通过转录因子c-Myc和E-box 的相互作用激活CCAT1 启动子区域，使其活性增强从而增加CCAT1 的表达，且CCAT1 的高表达与胃癌的增殖、淋巴结转移等均相关，该研究提示c-Myc 诱导CCAT1 的表达在胃癌发生、发展中起关键作用。

Mei 等［9］发现相对于正常癌旁组织，lncRNA-SUMO1P3(smallubiquitin-like modifier 1 pseudogene 3，SUMO1P3)在胃癌组织中呈现高表达，与性别、年龄、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、侵袭及CEA 水平均相关，即男性患者表达水平较女性患者高，年轻患者较老年患者高，癌组织的分化程度越低其表达水平越高。该研究结果表明一些假基因，如SUMO1P3，可在RNA水平上参与癌症的发生、发展。

胃癌组织中除了发现有表达上调的lncRNA，同样也发现了许多表达下调的lncRNA。如Sun 等［10］采用RT-PCR 对胃癌组织中lncRNA-AC096655.1-002 的表达水平进行分析，发现相比于癌旁正常组织，AC096655.1-002 表达水平下降59%，且其表达水平与淋巴结转移、远处转移、转移分期及肿瘤细胞分化程度相关。在胃癌组织中并非只有AC096655.1-002 的表达水平下调，Sun 等［11］通过对72 例胃癌样本研究发现，与邻近的癌旁正常组织相比，lncRNA-MEG3 在胃癌组织中表达水平也显著下调，与高水平表达MEG3患者相比，低水平表达患者的预后更差。此外，通过体外细胞实验发现在多种胃癌细胞株中MEG3 的表达缺失，其机制可能与DNA 的甲基化修饰有关;其高表达不仅能够抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，且能使p53 蛋白在胃癌细胞株中积聚。该研究表明MEG3 有望成为新的肿瘤抑制基因，其表达缺失或降低可促进胃癌的发生、发展。

2.2 lncRNA 与结直肠癌 近期有研究发现lncRNAHOTAIR、CCAT1 不仅与胃癌发生、发展相关，且与结直肠癌(colorectal cancers，CRC)的发生、发展密切相关。Kogo 等［12］通过研究100 例已发生肝转移Ⅳ期结直肠肿瘤患者中HOTAIR 的表达水平，采用定量PCR检测患者癌及癌旁组织HOTAIR 的表达水平，结果提示癌组织中HOTAIR 表达显著高于癌旁组织，其表达水平与结直肠癌发生肝转移的风险相关。多因素分析显示HOTAIR 的表达水平是影响患者总生存时间的独立预后因素，并且相较于低表达HOTAIR 的患者，高表达者预后更差;利用cDNA 微阵列数据进行基因探针富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，结果提示HOTAIR 作用机制是通过其5＇端结构域结合PRC2(ploycomb repressive complex 2)，而3＇端结构域结合组蛋白去甲基化酶复合体(LSD1/CoREST/REST)，并介导这两种复合体定位至HOXD 位点，分别使染色体组蛋白H3 第27 位赖氨酸三甲基化(Histone H3 Dimethyl Lys27，H3K27me3)和组蛋白H3 第4 位赖氨酸去二甲基化(Histone H3 Dimethyl Lys4，H3K4me2)，使相关该位点基因沉默从而促进肿瘤细胞的生长。该研究结果提示HOTAIR 很可能在结直肠肿瘤发生、发展及肝转移中发挥关键作用。

Nissan 等［13］发现在28 例原发性结直肠腺癌患者中有85%的患者lncRNA-CCAT1 表达量相对于正常患者上调至少30 倍，外周血液样本中有40%的患者表达上调。此外，对4 例已发生前哨淋巴结转移及5例尚未发生前哨淋巴结转移的结直肠癌患者前哨淋巴结进行分析，结果发现已发生转移患者的前哨淋巴结中均可检测到CCAT1 的过表达，而尚未转移者则有40%的患者前哨淋巴结能检测到CCAT1 的过表达。该研究结果表明相比于传统的粪便隐血试验及结直肠镜检查，CCAT1 更具灵敏性，是有望成为具有特异性和可操作性的结直肠癌检测的标记物。

lncRNA-HULC(highy upregulated in liver cancer)是Panzitt 等［14］在研究肝细胞癌基因表达的微阵列中发现的上调表达最高的转录本，是首个被发现在肝细胞癌胞质中过表达的lncRNA。早些年的研究一直认为HULC 只在肝脏中表达，但后续Matouk 等［15］的研究表明，除原发性肝细胞癌外，HULC 在结直肠癌肝转移组织中也呈高表达，但在结直肠癌淋巴结转组织中却没有检测到HULC 的表达。研究结果表明，对于结直肠癌发生肝转移者，检测HULC 的组织表达水平能够及早发现转移情况，对患者预后起一定的预测作用。

转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)基因长度＞7 kb，在肺癌患者转移灶组织呈现过表达，故命名为转移相关肺腺癌转录本1［16］。有研究表明，MALAT1 并非仅在肺腺癌转移灶组织中表达，Xu 等［17］在研究结直肠癌转移发生机制时，发现MALAT1 在50%的结肠癌样本中呈高表达，并且MALAT1 的3＇末端区域存在突变，进一步研究证明MALAT1 的3＇末端区域突变在CRC 细胞的增殖、转移和侵袭中起着重要作用。

在结直肠癌组织中，除了有HOTAIR、CCAT1、HULC、MALAT1 的过表达，还有PCAT-1、OCC1 同样呈现表达上调趋势。对108 例CRC 组织样本及相应的81 例癌旁正常组织样本的lncRNA-PCAT-1 表达水平进行RT-PCR 分析，结果发现，与正常组织比较，CRC样本中PCAT-1 的表达情况显著上调，并且在64%的CRC 样本中发现PCAT-1 的过表达(即上调超过50%)。此外，PCAT-1 的表达和肿瘤远处转移存在明显的相关性。更重要的是，PCAT-1 高表达的CRC 患者较低表达患者总生存时间显著缩短［18］。以上研究数据提示PCAT-1 参与了CRC 的发生、发展过程，并可能作为结直肠癌患者不良预后判断的新指标。Pibouin 等［19］发现OCC1 基因转录产物lncRNA-OCC-1相对于正常黏膜组织表达水平明显升高，在正常黏膜中无或很少表达，具有明显的组织特异性。

对lncRNA 在结直肠癌中的研究发现除了有表达上调的lncRNA，同样也有表达下调的lncRNA。有研究资料证实lncRNA-LOC285194［20］在骨肉瘤发生、发展中起着肿瘤抑制的作用，Qi 等［21］通过对81 例CRC患者样本进行分析发现，LOC285194 与结直肠癌的发生、发展具有一定的相关性，与正常组织比，癌组织中LOC285194 表达显著下调，体外癌细胞株培养实验研究发现LOC285194 表达同样呈下调状态，并且对81例结直肠癌患者进行随访5 年后发现LOC285194 低表达组较高表达组的预后差，但LOC285194 发挥作用的具体分子机制尚不明确。Zhai 等［22］发现在结直肠癌组织中lncRNA-p21 表达呈下调状态，结肠肿瘤比直肠肿瘤患者表现出较低的表达水平，且与血管侵袭相关，这些结果表明p21 可能参与CRC 发生，且与其预后相关。

2.3 lncRNA 与胃肠道间质瘤 胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是起源于消化道间叶组织中具有多向分化潜能的原始间叶干细胞的一类良恶性肿瘤，多见于中老年人，肿瘤小者(＜2 cm)一般无症状，内镜活检可能为阴性，大多在肿瘤普查、体检或其他手术时无意发现。Niinuma 等［23］通过对56 例GIST 样本进行基因芯片分析，研究结果与结直肠癌相似，发现高表达的lncRNA-HOTAIR，体外实验也证实下调HOTAIR 的表达能抑制GIST 细胞的侵袭能力，说明其表达水平与GIST 的分级与转移关系密切，是GIST 发生的危险因素，有可能成为治疗GIST 的新靶点。该研究结果提示HOTAIR 不仅与上皮来源肿瘤的转移和侵袭能力相关，而且与间叶组织来源的GIST 的转移也相关，更拓宽了HOTAIR 介导肿瘤转移的范围，提示HOTAIR 在调控肿瘤的转移中具有普遍意义。

2.4 lncRNA 与其他胃肠道疾病 相比GIST 的研究，有关lncRNA 在胃肠道良性疾病方面的研究较少。在对酒精性肝病及慢性非酒精性肝病的研究中，Oliva等［24］利用二乙基-1、4-二氢-2、4、6、-三甲基-3、5-吡啶脱羧基产物(diethyl-1、4-dihydro-2、4、6-trimethyl-3、5-pyridine decarboxylate，DDC)喂养小鼠诱导小鼠产生mallory 小体(Mallory-Denk bodies，MDBs)，通过RTPCR、RNA 荧光原位杂交技术研究小鼠肝脏组织，结果显示，H19、AIR 表达上调，而MEG3 表达下调，此外还发现S-腺苷甲硫氨酸能够抑制这些lncRNA 的表达变化，而三甲铵乙内酯仅能抑制H19、AIR 的表达，以上研究结果有望为酒精性肝病的诊治及预防提供新的线索。对H19 早期研究发现，印迹缺失(loss of imprinting，LOI)能够诱发H19 等位基因的表达，从而诱发肿瘤，Micha 等［25］为了研究H19 在胰腺组织中的情况，通过对胰腺癌、慢性胰腺炎、正常胰腺三种组织进行PCR 及RNA 分子杂交分析，结果显示在慢性胰腺炎、正常胰腺组织中均发现H19 印迹，而在胰腺癌组织中发现H19 印迹缺失。在自身免疫性肝病的研究中，张蕾等［26］通过对42 例原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)患者及40 例健康者外周血单个核细胞中lncRNA-AK053349 的相对表达量进行分析，发现PBC 患者外周血单个核细胞中AK053349的表达量较正常对照组明显增高，且随PBC 分期的不同，其表达量有明显差异，且AK053349 表达量与Mayo危险评分呈正相关，该研究提示AK053349 可能参与了PBC 的发病过程。

最初的研究认为lncRNA 在生物体内不具有生物学功能，然而，随着人们对lncRNA 与多种疾病关系的日益关注，越来越多与消化系统疾病相关lncRNA 陆续被发现，特别是与消化道肿瘤方面，尽管它们在消化系统肿瘤发生、发展中的具体作用机制仍有待进一步研究，然而在体内和体外研究中干预异常表达的lncRNA 显示出不同程度的增殖抑制和凋亡诱导效应，这些都显示出lncRNA 在未来肿瘤靶点治疗中所具有的巨大潜力，可能成为消化系统瘤肿诊断、预后判断及治疗的新靶点。

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