Dermokine-β mRNA在结肠癌组织中的水平及临床意义*

付汉东，张爱华，刘汉忠，袁岸龙，魏 威 (湖北省孝感孝感市中心医院/华中科技大学同济医学院附属孝感医院：.中心实验室；.普外科；.病理科；.消化内科，湖北孝感 000)



·论 著·

Dermokine-β mRNA在结肠癌组织中的水平及临床意义*

付汉东1，张爱华2，刘汉忠3，袁岸龙4，魏 威1
(湖北省孝感孝感市中心医院/华中科技大学同济医学院附属孝感医院：1.中心实验室；2.普外科；3.病理科；4.消化内科，湖北孝感 432000)

目的 研究Dermokine(DK)-β mRNA在结肠癌组织中的水平和临床价值。方法 采用RT-PCR法检测DK-β mRNA相对水平，对结肠癌患者、结肠息肉、溃疡性结肠炎患者以及健康对照组DK-β mRNA相对水平进行比较，对结肠癌不同临床参数间DK-β mRNA相对水平进行比较，并进行统计学分析。结果 结肠癌患者DK-β mRNA表达比结肠息肉、溃疡性结肠炎患者以及健康对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；但与患者年龄、性别、肿瘤的位置、大小无相关性，在低分化腺癌、Dukes分期B 期、有淋巴结转移的患者中DK-β mRNA表达更明显(P<0.05)。结论 结肠癌DK-β表达与结肠癌患者黏膜上皮细胞受损密切相关，B 期DK-β表达呈显著升高，因此结肠组织DK-β水平检测可作为结肠癌早期诊断的指标，对临床结肠癌早期诊断有一定价值。

结肠癌； DK-β； mRNA

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国已成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一[1]，由于目前结肠癌的早期诊断水平较低，约1/3的患者明确诊断时疾病已处于进展期[2]，因此结肠癌的延误诊断是影响诊断和预后的重要原因[3]。Dermokine(DK)是结直肠上皮细胞角化后分泌的一种多肽,主要是缩氨酸，目前研究显示DK至少有13种不同的亚型[4]，其中DK-β在早期结肠癌患者血清中的水平是呈显著升高的[5]。作者通过检测结肠癌组织中DK-β mRNA的相对水平变化来研究DK-β对国内人群早期结肠癌诊断的价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1～9月在本院住院治疗的结肠癌患者30例，其中男18例，女12例；年龄26～81岁，参照文献[6]按年龄分：≥60岁的老年患者14例，41～59岁的中年患者13例，≤40岁的青年患者3例；以肿瘤大小5 cm为临界值[6](CT或MRI测量直径，多个肿瘤时取直径最大者)：≥5 cm 16例，<5 cm 14例；肿瘤部位：升结肠癌11例，横结肠癌2 例，降结肠癌4例，乙状结肠癌13例；淋巴结转移：有13例，无17例；病理组织学分级：高分化腺癌4例，中分化腺癌12例，低分化腺癌11例，黏液腺癌3例，Dukes分期：A期6例，B期12例，C期8例，D期4例；以上病例匀符合病理学结肠癌诊断标准[7]。同期从门诊和住院结肠息肉和溃疡性结肠炎(UC)患者中各随机抽取20例作为对照，每组中男12例、女8例，年龄20～67岁、平均45.6岁。同时从同期健康体检人群中抽取30例作为健康对照组,其中男18例、女12例，年龄18～65岁、平均44岁。

1.2 标本采集 手术取患者肿瘤及周围组织，癌旁正常组织为距肿瘤边缘5 cm以上的肠段组织(病理证实肿瘤标本切缘肿瘤细胞残留均为阴性)，对照组在肠镜下取结肠息肉和炎症组织，健康对照组在肠镜下取少许结肠组织，快速切取组织，用预冷的1×PBS 液冲洗。放置于无RNA酶的冻存管中，保存于-86 ℃冰箱中待检。

1.3 试剂与仪器 试剂：反转录试剂盒(美国Sigma公司)，总RNA提取试剂盒(美国Sigma公司)，β-actin 基因试剂盒(美国Sigma公司)，琼脂糖(美国Invitrogen公司)，Taq DNA聚合酶(上海华美公司)，二乙基焦磷酰胺(DEPC)，液氮，无水乙醇、氯仿、溴化乙啶等。引物设计如下，DK-β上游引物:5′-ATGAAGCCGGCCACTGCCTCTG-3′,下游引物:5′-GCAGGCCAGGTTGCACCCGGG-3′，扩增范围379 bp;β-actin上游引物:5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3′,下游引物:5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′,扩增范围158 bp(郑州美博公司)。仪器:TC9600-G-230V型MultiGene梯度PCR仪(美国Labnet公司)，DYCZ-21型电泳仪(北京六一仪器厂)，Tanon-3500凝胶成像分析系统(上海天能公司)，TG328型电子天平(上海上天公司)，TGL-16M高速低温离心机(湖南湘仪公司)，YQ-3型电动匀浆机(华城开元实验仪器厂)，移液器(芬兰Biohit公司)等。检测中所有操作严格按试剂和仪器说明书要求进行。

1.4 组织RNA提取 用Trizol法提取组织中的总RNA，RNA的提取、完整性、纯度及浓度检测操作程序严格按试剂盒说明书要求进行，经质量检测RNA的完整性、纯度及浓度均符合要求后方可用扩增。

1.5 扩增和电泳 反应体系Ⅰ：Rnasin 1 μL，RT-PCR缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，反转录酶1 μL，OligodT 1 μL，RNA 4 μL，加无RNase灭菌蒸馏水至20 μL。把反应体系Ⅰ放在PCR仪反应孔中，设置反应模式。循环模式：37 ℃反转录60 min，得到cDNA。反应体系Ⅱ：RT-PCR缓冲液2 μL，dNTPs 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶 1.5 U，cDNA 2 μL，PCRTye 2 μL，加无RNase灭菌蒸馏水至20 μL。循环模式：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循环40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存待凝胶电泳检测。电泳：将6 μL扩增产物与2 μL溴酚蓝上样缓冲液混合，在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，恒压80 V，30 min后，用凝胶成像系统观察结果。

1.6 结果判断标准 凝胶成像仪观察结果，进行面积灰度扫描，DK-β mRNA相对表达量A值= DK-β mRNA产物的吸光度A值(OD)/β-actin产物的吸光度A值(OD)。

2 结 果

2.1 各组DK-βmRNA相对水平 结肠癌患者DK-βmRNA相对水平为0.82±0.46，比结肠息肉(0.34±0.16)、溃疡性结肠炎(0.29±0.18)、健康对照组(0.14±0.11)均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；结肠息肉与溃疡性结肠炎间DK-βmRNA相对水平无明显差异，但均比健康对照组高(P<0.05)。

2.2DK-βmRNA相对水平与结肠癌患者临床病理参数的关系 见表1。DK-βmRNA的表达与患者年龄、性别、肿瘤的位置与大小无关，在不同组织学分级中低分化腺癌DK-βmRNA表达更明显(P<0.05),不同Dukes分期中B期表达更明显(P<0.05),有淋巴结转移的比无淋巴结转移表达更明显(P<0.01)。

表1 DK-β mRNA相对水平与结肠癌患者临床病理参数的关系

3 讨 论

目前研究显示DK位于人类染色体19q13.12上，是由一定数量的表皮特异基因组成[8]。DK至少有13种亚型，可编码10多种不同的蛋白质，其中β型(相对分子质量45×103)拥有自己的启动子，并在表皮细胞上表达，DK-β是以高度分化的上皮细胞层分层分泌的形式表达的[4]。炎症条件下相关组织的上皮细胞的DK基因表达是有差异的，这种差异性也促进炎症状态的差异性[9]。研究表明在上皮细胞层广泛受损中存在DK-β的高水平表达[10]。

本研究显示结肠癌患者DK-βmRNA相对水平均比结肠息肉、溃疡性结肠炎、健康对照组明显升高(P<0.01)。结肠黏膜上皮细胞是通过细胞桥粒连接呈相互嵌合紧密排列的，其间隙由膜被颗粒排出物充填，使结肠黏膜具有独特的生物学特性[11]，结肠黏膜上皮受到损伤可形成溃疡性结肠炎，导致黏膜上皮细胞角化，黏膜组织发生异型增生，同时溃疡性结肠炎中炎症上皮细胞Bcl-2表达增高，炎症细胞凋亡停止或减慢，造成溃疡性结肠炎中大量炎症细胞浸润肠壁和持续活化[12]，从结肠息肉、溃疡性结肠炎发展到结肠癌，是一个长期的过程，在早期发生APC基因突变，中期发生ras基因突变，晚期发生p53突变，最终导致癌变[13]，在此过程中伴有黏膜组织的异型增生和炎症的长期存在，导致结肠黏膜上皮细胞层长期广泛受损，DK-β表达也逐渐升高。由于NF-κB、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)和一氧化氮合酶(iNOS)[14]等在炎性黏膜中表达显著升高,这些导致黏膜上皮细胞角化和增生、异生加剧；角化细胞衰老、凋亡的调控受干扰素、APC基因、ras基因信号通路的调控，当APC基因和(或)ras基因发生突变时APC基因、ras基因信号通路受到影响，这种调控机制可能被打破，从而导致角化的黏膜上皮细胞分泌DK-β增加，这也是结肠癌患者DK-βmRNA相对水平比对照组都要高的原因，在低分化腺癌、Dukes分期B期、有淋巴结转移的患者中表达更明显(P<0.05)，同时早期结肠癌患者血清DK-β水平显著升高[15]，这由于癌细胞对周围组织浸润，导致结肠局部黏膜上皮细胞层广泛受损，并使淋巴结转移的黏膜上皮细胞层受损，从而引起DK-β表达水平显著升高[5]，并大量聚集在病变周围组织，但与患者年龄、性别、肿瘤的位置及大小无关。结肠息肉与溃疡性结肠炎间DK-βmRNA相对水平无明显差异，但它们比健康对照组要高(P<0.05)，是由于炎症局部黏膜上皮细胞层受损导致DK-β表达轻度升高，但升高幅度较结肠癌低得多。

DK-βmRNA在结肠癌早期和进展期表达是显著升高的，因此组织中DK-β水平检测对结肠癌的早期诊断和治疗有重要意义。

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Level of Dermokine-β mRNA in colon cancer tissue and its clinical significance*

FUHan-dong1,ZHANGAi-hua2,LIUHan-zhong3,YUANAn-long4,WEIWei1
(1.CentralLaboratory;2.DepartmentofGeneralSurgery;3.DepartmentofPathology;4.DepartmentofGastroenterology,XiaoganMunicipalCentralHospital/AffiliatedXiaoganHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofSciencesandTechnology,Xiaogan,Hubei432000,China)

Objective To investigate the level of dermokine-β(DK-β) mRNA in colon cancer tissue and its clinical value.Methods The RT-PCR method was used to detect DK-β mRNA relative level.The DK-β mRNA relative levels were compared among the patients with colon cancer,colonic polyps and ulcerative colitis and normal control group.The DK-β mRNA relative levels were compared among different clinical parameters in colon carcinoma.The statistical awalysis was performed.Results The expression of DK-β mRNA in the patients with colon cancer was significantly higher than that in the patients with colon polyps,ulcerative colitis and normal control group,the difference was statistically significant(P<0.01).But the DK-β mRNA expression had no correlation with age,gender,tumor location and size.The DK-β mRNA expression in the low differentiation adenocarcinoma,Dukes B stage and lymph node metastasis was more significant (P<0.05).Conclusion The DK-β expression in colon cancer is closely associated with mucosal epithelial cell damage.The DK-β expression in the stage B is significantly increased.Therefore,the DK-β level detection in colon tissue may be used as an index of early diagnosis of colon cancer,which has a certain value for early diagnosis of colon cancer.

colon cancer； dermokine-β； mRNA

湖北省自然科学基金项目(2013CFB486)；湖北省孝感市科技局基金支持项目(2011XXF042)。

付汉东，男，在职研究生，医学硕士，副主任技师，主要从事肿瘤早期诊断和肿瘤标志物研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.003

A

1672-9455(2015)21-3137-03

2015-01-02

2015-08-31)