日本血吸虫腺苷酸激酶-1与程序性细胞死亡蛋白-10基因的克隆表达及其在发育中表达的变化*

高彦茹 熊 涛 黄文铃 赵琴平 明珍平 钟沁萍 蒋明森 董惠芬

武汉大学基础医学院人体寄生虫学教研室，武汉 430071；#通讯作者

日本血吸虫腺苷酸激酶-1与程序性细胞死亡蛋白-10基因的克隆表达及其在发育中表达的变化*

高彦茹 熊 涛 黄文铃 赵琴平 明珍平 钟沁萍 蒋明森 董惠芬#

武汉大学基础医学院人体寄生虫学教研室，武汉 430071；#通讯作者

目的：克隆、表达、定位日本血吸虫腺苷酸激酶-1(Schistosoma Japonicum Adenylate Kinase-1，SjAK1)及日本血吸虫程序性细胞死亡蛋白-10(Schistosoma Japonicum Programmed Cell Death-10，SjPCD10)，为进一步研究其基因在生长发育中的功能奠定基础。方法：据SjAK1、SjPCD10基因完整开放阅读框(长度分别为594bp、651bp)分别设计并合成特异性引物，提取日本血吸虫成虫总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板分别扩增SjAK1、SjPCD10目的基因片段，与载体pET28a质粒共同进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序鉴定后，抽提重组质粒，转化表达宿主菌BL21。PCR鉴定阳性重组克隆，IPTG诱导表达，SDS-PAGE、Western Bloting检测表达结果，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，BCA法定量目的蛋白；ATP荧光检测试剂盒检测重组SjAK1的活性。将目的蛋白分别免疫新西兰兔制备多抗，ELISA鉴定多抗效价。免疫组化法检测SjAK1和SjPCD10基因在日本血吸虫皮肤型童虫(30min)、肺型童虫(3天)、肝门型童虫(10天、14天、18天、22天)以及成虫(26天)中表达的变化。结果：成功构建重组表达质粒pET28- SjAK1和pET28- SjPCD10，原核表达的目的蛋白rSjAK1为可溶性、rSjPCD10呈包涵体形式；SDS-PAGE鉴定目的蛋白rSjAK1约26kDa、rSjPCD10约28kDa，与理论分子量一致；经镍柱亲和层析纯化获得高纯度目的蛋白，rSjAK1的比酶活为135.2U/mg。将目的蛋白免疫新西兰兔后血清效价均高于1∶1 280。免疫组化结果显示，SjAK1在各型童虫均有表达，皮肤型和肺型童虫中表达较少，肝门型童虫感染10天开始增加，但成虫期表达又减少；SjPCD10从18天开始表达增多，在雄虫和虫卵表达最为明显。结论：本实验成功克隆表达及纯化SjAK1、SjPCD10，其基因在日本血吸虫发育过程中均有表达，为深入研究其基因功能奠定了基础。

日本血吸虫；腺苷酸激酶；程序性细胞死亡蛋白；克隆表达；虫体发育

国家自然科学基金(No.81273010)