广西汉族人群NPC1L1基因1 735C＞G多态性分布特征及与血脂、肥胖的关系＊

苗 林，尹瑞兴，吴东峰

（1.广西医科大学第四附属医院心内科，广西柳州545005；2.广西医科大学第一附属医院心内科，南宁530021；3.广西壮族自治区人民医院综合干部病区，南宁530021）

血脂代谢紊乱和肥胖是动脉粥样硬化和冠心病发生、发展的重要危险因素［1－2］。尼曼－匹克 C1样1（NPC1L1）蛋白是胆固醇跨膜转运的关键物质，在小肠中高度表达，影响肠道胆固醇的吸收，以及调节其他血脂代谢基因的活性，对全身胆固醇稳态起着关键的调控作用［3－4］。研究显示，NPC1L1基因多态性对其蛋白功能具有重要生物学效应，从而影响胆固醇的水平［5－11］。本文研究 NPC1L1基因1 735C＞G（rs2072183）多态性位点对血脂水平和肥胖的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在广西罗城县采用分层随机整群抽样的方法组建了汉族人群标本库，从中随机抽取409名汉族人群作为研究对象。其中男155例，女254例。排除有心脏病史、中风史，糖尿病或空腹血糖水平大于或等于7.0mmol/L者，及正在使用他汀类、贝特类、胆固醇吸收抑制剂（如依泽麦布片）、激素等影响血脂代谢相关药物者。纳入研究前患者均签署知情同意书。本研究经广西医科大学医学伦理委员会许可。

1.2 方法 体检项目：由专门人员测量身高、体质量、腰围和血压等，并计算出BMI。专科医师询问既往病史及生活习惯。血标本采集及生化指标检测：禁食12h，清晨空腹，坐位采取静脉血8mL，离心获取血清。血清总胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）的检测采用标准酶法；血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）采用酶联免疫一步法测定，载脂蛋白 A－I（ApoA－I）和载脂蛋白B（ApoB）采用免疫透射比浊法。均在广西医科大学第一附属医院检验中心统一测定。DNA提取及PCR扩增：取静脉血3mL，采用苯酚－氯仿法提取基因组 DNA［12］。上游引物：5′－GGG ATG ACA GAT AGC ACC AA－3′，下 游 引 物：5′－GAC ATC ACC TTC CAC CTC TTG－3′。PCR反应体系为25μL：2.0μL模板DNA，12.5μL2×Taq PCR MasterMix（北京天根生物公司），上下游引物各1.0μL（10μmol/L），不足部分去离子水补足。PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸8min。PCR产物使用TaqⅠ内切酶酶切。总反应体系10μL：PCR产物5μL，TaqⅠ5U（Fermentas公司），10×Buffer 1μL，不足体积去离子水补足，65℃水浴12h，2.0%琼脂糖凝胶－核酸染料GELVIEW染色，100V电泳40min，紫外线下观察、摄影。将PCR产物及酶切产物与DNA片断长度标准物比较以鉴定基因型。PCR产物为437bp；野生基因型CC酶切产物为2条带，分别为169 bp和268bp；突变型GG为437bp；杂合型CG则为3条带，分别是437、169、268bp。随机抽取3种基因型PCR产物经上海生工测序证实。

表1 研究对象男女组间一般情况比较

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量资料用±s表示，两样本均数间的比较用t检验，TG水平不符合正态分布，采用中位数及四分位间距表示，采用非参数检验；计数资料比较用χ2检验。所有基因型的Hardy－Weinberg平衡采用频数分布拟优合度的χ2检验；不同基因型间血脂水平比较用协方差分析（ANCOVA）；用多重线性回归分析基因型及性别、年龄、血压、血糖、饮酒、吸烟等环境因素与血脂水平和BMI的关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况比较 男性具有较高的BMI、腰围、收缩压、舒张压、TC、TG、LDL－C、ApoB水平和较低的 HDL－C水平（P＜0.05）。两组间年龄、血糖和ApoA－Ⅰ水平差异无统计学意义，男性中吸烟和饮酒比例明显高于女性（P＜0.05）。见表1。

2.2 电泳结果 NPC1L1基因rs2072183多态性的突变电泳图谱，1条带（437bp）为突变纯合子，2条带（169、268bp）为野生纯合子，3条带（437、169、268bp）为杂合子。测序证实，见图1、2。

图1 PCR产物酶切后电泳结果

图2 3种基因型测序图

表2 不同基因型各项指标的比较（±s）

表2 不同基因型各项指标的比较（±s）

基因型 n TC（mmol/L）TG［M（QR2），mmol/L］HDL－C（mmol/L）LDL－C（mmol/L）ApoA－Ⅰ（g/L）ApoB（g/L） BMI（kg/m2）21±3.71 CG 188 5.07±1.12 1.07（0.79） 1.77±0.62 2.99±0.87 1.34±0.26 0.87±0.19 22.10±2.87 GG 60 5.13±1.05 0.99（1.35） 1.69±0.46 3.11±1.03 1.30±0.23 0.89±0.21 23.39±3.49 F 1.501 0.280 1.167 4.678 0.358 3.917 3.312 P CC 161 4.88±0.94 1.07（0.90） 1.70±0.40 2.73±0.75 1.34±0.25 0.82±0.19 22.0.224 0.869 0.312 0.010 0.699 0.021 0.037

2.3 基因分布 NPC1L1基因rs2072183多态性在广西汉族人群中的分布符合Hardy－Weinberg平衡。409例研究对象中CC、CG、GG基因型的分布频率为39.40%、46.00%、14.60%，C和G等位基因频率分别为62.35%和37.65%。男女之间基因型分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 NPC1L1基因型与血脂水平和BMI的关系 3种基因型间LDL－C、ApoB和BMI水平存在显著差异。G等位基因携带者具有较高的LDL－C和ApoB水平，CC和CG/GG组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。GG基因型具有较高的BMI，但G等位基因携带组与CC组比较，BMI差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.5 血脂和BMI相关因素分析 多元线性回归分析显示血脂和BMI与多种环境因素有着密切关系（P＜0.05），仅LDLC及ApoB水平与基因型有相关性（P＜0.05）。BMI未发现与基因型有相关性，见表3。

表3 血脂和BMI相关因素分析

续表3 血脂和BMI相关因素分析

3 讨 论

NPC1L1蛋白作为依泽麦布的作用靶点，调节肠腔内胆固醇的吸收而为人熟知。NPC1L1蛋白主要分布于小肠上皮细胞的刷状缘和肝细胞内，在结构上具有13个跨细胞膜区和固醇感知区域［13］。NPC1L1基因定位于染色体7p133，包括20个外显子，19个内含子［13］。研究发现，该基因单核苷酸基因多态性（SNP）影响胆固醇的吸收及血脂水平。1 735C＞G多态性位于第2外显子的编码区，关于其多态性分布特征，以及是否与血脂水平和肥胖相关的研究较少。

本研究发现，中国广西汉族人群G等位基因频率为37.65%，GG、GC和 CC基因型频率分别为14.60%、46.00%和39.40%，男女之间等位基因分布无差异。广西汉族G等位基因和GG基因型频率与台湾人群的35.7%、10.71%和上海地区汉族人群的37.3%、12.6%非常相似［7，14］，但均低于日本人群的41.90%和19.01%［9］。与欧美人群比较［11］，在高加索白人、美籍黑人和西班牙人群中，突变基因G频率分别为21.9%、28.3% 和17.9%，明显低于亚洲人群。这提示G等位基因的突变具有显著的种族差异性。

Teslovich等［15］进行的多中心的 GWAS研究发现NPC1L1基因变异与血脂代谢显著相关，rs2072183多态性对血清TC和LDL－C水平有着重要影响。本研究显示rs2072183多态性不仅对血脂水平，而且对BMI也有着重要影响。G等位基因携带者的血清LDL－C和ApoB水平显著高于CC基因型组（P＜0.05），多元线性回归分析亦表明LDL－C和ApoB和基因型有相关性。这和Polisecki等［8］在欧洲老年人中的研究结果一致，但却和在其他亚裔人群的研究结果有所不同。Maeda等［9］在日本人群的研究显示突变基因G对血清TC，HDL－C，LDL－C和 ApoB水平无显著性影响，但 GG可升高菜油甾醇（胆固醇吸收的标志）的水平，提示G等位基因可增加肠腔内胆固醇的吸收，从而增加动脉粥样硬化的风险。Zhao等［5］研究发现基因1 735C＞G多态性位点尚通过形成单倍体影响血脂水平，比如单体型－18A－1735C－U328650A＞G较其他单体型的血清LDL－C基础水平低1.8mg/dL。综上可见，NPC1L1基因1 735C＞G多态性对血脂代谢有着重要影响，携带突变等位基因G的人群可能有着较高的血脂水平，但在不同种族中其对血脂谱的影响不同。多因素分析显示多种环境因素与血脂谱相关，这种差异性也可能与环境因素或环境－基因相互作用对血脂谱的影响有关。

研究显示NPC1L1基因敲除小鼠可避免肥胖［16］，但研究未得到一致结果［17］。BMI作为肥胖的重要衡量指标，本研究表明，3种基因型间BMI水平差异有统计学意义（P＜0.05），且GG基因有着较高的BMI水平。但合并GG/GC后这种差异性消失，多元回归分析亦未发现相关性。该结果提示NPC1L1基因1 735C＞G多态性可能影响肥胖的发生，但其是否为肥胖易感基因或是通过增加胆固醇的吸收而影响有待进一步研究。

不可否认，本研究存在一定局限性。（1）本研究共入选了409例某一地区汉族人群，样本量小、单一，尚需在大样本、不同种族人群中进行验证。（2）本研究仅探讨了NPC1Ll基因单个多态位点与血脂谱和BMI的关系。由于单个位点的微小性，以及基因－基因和基因－环境因素的相互影响，可能导致与其他结果的不一致，尚需进一步研究多个位点进行关联分析。（3）进一步开展机制和功能方面的研究。

本研究发现，NPC1L1基因1 735C＞G多态性在中国汉族人群中广泛存在，具有显著的种族差异性。该基因突变位点G可能是高LDL－C水平和肥胖的一个危险因素。

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