尿激酶型纤溶酶原激活物在子宫内膜异位症中的表达及意义＊

白治苗，卢玉凤，杨 眉，年 研，哈春芳

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院妇产科，银川750004；3.榆林市第二医院，陕西719000）

尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasmino－gen activator，uPA）是尿激酶型纤溶酶原激活系统（简称uPA系统）的一个重要组成部分，主要在细胞外基质、基底膜等多种成分的降解中发挥作用，是维持细胞外基质动态平衡的一种关键因子［1－2］。在正常情况下，uPA存在于人或动物的血液、尿中，其本质是一种丝氨酸蛋白酶，具有将无活性的纤溶酶原转化成有活性的纤溶酶的作用，从而激活体内的纤溶系统，但纤溶酶原激活物抑制物－1（PAI－1）能特异性地抑制uPA的活性，从而保证了机体细胞外基质的动态平衡。子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）简称内异症，容易引起女性，尤其是育龄期妇女下腹坠胀痛、月经失调、性交痛，以及不孕等症状的常见良性疾病。但EMs却有着类似恶性肿瘤的黏附、种植、侵袭及远处转移等生物学行为。该病的病因与发病机制尚不明确，目前被普遍接受的是1921年Sampson提出的子宫内膜种植学说，于经期时子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞随经血逆流，经输卵管进入盆腔并种植于卵巢和邻近的腹膜。这一学说在动物实验中已被证实，但经血中的腺上皮、间质细胞是如何黏附并种植于腹膜细胞外基质中的，目前尚不清楚。因此，推测原位内膜uPA的活性增强，PAI－1的抑制作用不足，使经血中的内膜碎片降解腹膜细胞外基质的能力增加，为子宫内膜的异位黏附、种植创造了条件。本研究试图通过免疫组织化学和RT－PCR检测uPA蛋白、mRNA在EMs患者在位、异位及正常内膜组中的表达，由此阐述uPA在EMs发病机制中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2014年9月于宁夏医科大学总医院妇产科因EMs行手术治疗并于术中或术后确诊的病理存档石蜡标本及新鲜组织各35例，纳入病例组。按照美国生育协会（AFS）修正EMs分期法（1985），所有病例组患者均处于Ⅱ期。收集同年因子宫肌瘤经手术治疗并排除EMs的正常子宫内膜30例作为对照组。纳入标准：所有病例组及对照组患者于手术前月经周期均正常，病例组于术中或术后证实为EMs，两组近3个月均未接受过激素类药物的治疗，无不孕、子宫内膜非典型性增生、宫颈上皮内瘤变、生殖道炎症等其他妇科器质性疾病，患者年龄在25～45岁，平均（30.50±4.98）岁。

1.2 主要试剂 兔抗人uPA多克隆抗体由美国abcam生物公司生产（稀释浓度分别为1∶100），兔超敏二步法免疫组织化学检测试剂PV－6001，DAB显色试剂盒均由北京中杉生物工程公司生产。RT－PCR所需引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，cDNA反转录核，免疫荧光定量试剂盒均购置于Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学 所有标本均由病理科证实，由甲醛浸泡过夜，10%甲醛固定，程序脱水、石蜡包埋，3～4μm厚度连续切片，65℃烤箱烤片过夜，脱蜡、水洗、抗原修复、一抗孵育过夜、PBS冲洗、二抗孵育2h、显色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明及中性树胶封片，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 RT－PCR步骤 引物根据引物设计原则，采用引物设计软件 Primer Premier 5 设 计，上游引 物：5′－GGG AGC AGA GAC ACT AAC GAC－3′，下 游 引 物：5′－CTT ACA CTC ACA GCC CAC ACA－3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.3 操作步骤（1）内膜组织中总 RNA提取：称取约50 mg在位或异位内膜组织置于含有液氮的匀浆器中，加入1mL预冷的TRIZOL充分匀浆后将裂解液移入1.5mL EP管，4℃，12 000r/min，离心10min，取上层裂解液加入0.2mL氯仿，混匀，冰浴5min，4℃，12 000r/min，离心10min，取上层水相加0.5mL异丙醇，颠倒混匀后冰浴10min，4℃，12 000 r/min，离心10min，小心去除上清液，加入1mL 75%乙醇，4℃，7 500r/min离心5min，弃去上清液，让沉淀RNA自然干燥5～10min.（2）RNA定量：用无RNA酶的水溶解RNA沉淀至20μL，取2μL于750紫外分度计测量RNA纯度及浓度，将终浓度稀释为1μg/μL。（3）反应条件：94℃ 预变性3 min，1个循环，94℃ 变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，各35个循环，72℃终反应5min。

1.4 结果判定标准（1）采用OLYMPUS.BX51正置荧光显微镜观察染色结果，uPA以细胞质或基底膜中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。用image pro－plus 6.0专业图像分析软件对uPA蛋白的表达情况进行半定量分析，计算出每张切片的平均光密度值（IOD）。（2）RT－PCR 结果判定，用 BIO－RAD凝胶扫描系统分析摄像，用Roche－Lightcycler 96对产物半定量分析，以正常内膜、内异症在位内膜和异位内膜中uPA/GADPH mRNA表示相对量结果。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料用±s表示，采用单因素方差分析、两独立样本t检验等统计方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 uPA蛋白在3组中表达的结果 uPA蛋白主要表达于子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞的细胞质及基底膜中，极少数表达于血管内皮细胞中，见图1。其中uPA蛋白在EMs异位内膜组中的表达明显高于EMs在位内膜组、正常内膜组，EMs在位内膜组中的表达高于正常内膜组，其差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 uPA蛋白在3组内膜中的表达（SP×400）

图2 uPA蛋白在3组内膜中的表达

图3 uPA蛋白在3组内膜增生期、分泌期中的表达

2.2 uPA蛋白在3组内膜中增生期与分泌期的表达 uPA蛋白在3组内膜中的增生期与分泌期中的表达无明显差异（P＞0.05），见图3。

2.3 uPA mRNA在3组内膜中的相对表达量 其中uPA mRNA在EMs异位内膜组中的表达明显高于EMs在位内膜组、正常内膜组，在EMs在位内膜组中的表达高于正常内膜组，其差异均有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 uPA mRNA在3组内膜中的表达

3 讨 论

EMs发生可能要经过3个阶段即异位内膜的黏附、侵袭及血管形成，但异位内膜侵袭并破坏周围正常器官组织除了需要辨别、黏附的能力，还需要酶类，如蛋白水解酶，来降解细胞外基质、基底膜等细胞成分。在异位内膜的侵袭及转移过程中，存活及生长需要大量的微血管形成以保证其营养供应，而uPA在此过程中起着至关重要的作用。

uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，以无活性的单链（scuPA）和有活性的双链（tc－uPA）两种形式存在。当细胞合成和分泌的sc－uPA与其特异性受体uPAR结合后，scPA被酶解成具有纤溶酶原激活剂活性的双链形式tc－uPA，而大量有活性的uPA的聚集使纤溶酶原转变成纤溶酶，降解细胞外基质和基底膜等多种成分，且可上调uPAR的表达［3］。此外，uPA与uPAR结合可激活细胞内的信号传递途径，调节细胞增殖、远处转移和浸润等生物学行为［4］。国内有研究发现在癌变组织器官中uPA/uPAR高表达，也表明肿瘤细胞的侵袭、迁移与uPA/uPAR降解细胞外成分和激活细胞信号密切相关［5］。国外学者也在细胞和动物恶性肿瘤模型水平通过小干扰RNA或相关拮抗剂下调uPA和uPAR的表达，发现可以有效抑制恶性肿瘤细胞的侵袭、迁移及增殖［6－7］。EMs在病理上虽是良性疾病，但却有着类似于恶性肿瘤的种植、侵袭及远处转移的生物学行为。本研究结果表明，uPA蛋白在EMs患者异位内膜腺上皮、间质细胞中的表达明显高于EMs在位内膜及正常子宫内膜，uPA mRNA在EMs患者异位、在位内膜中的表达也明显增强，且在整个月经周期中持续表达，无明显的波动性，与陈露等［8］的研究结果uPA的高表达使其降解细胞周围基质及基底膜的能力增强，为异位内膜的黏附、侵袭、转移及形成异位病灶提供了必要条件的观点基本一致。国内学者的研究表明，在很大程度上肿瘤细胞中uPA的表达水平与其降解细胞外基质、基底膜等细胞组分及其侵袭转移能力密切相关［9］。因EMs的发病机制与恶性肿瘤相似，结合本研究的结果，发现该观点与EMs中uPA表达高低和异位内膜侵袭性关系的密切程度相吻合。此外，本实验结果还表明uPA蛋白在EMs患者异位内膜及在位内膜的血管内皮细胞中亦有表达，因此猜测uPA蛋白可能在异位内膜的血管形成中发挥至关重要的作用。uPA降解细胞外基质蛋白和基底膜，促使血管内皮细胞在周围组织间移动、增殖、聚集，更容易形成血管腔，为异位的内膜提供营养供应。国外学者的研究发现子宫内膜间质细胞释放uPA/PAI－1复合物，而该复合物可促使人血管内皮细胞的迁移，进一步支持uPA在EMs发病机制中的作用［10］。综上所述，uPA与EMs发病阶段中的异位内膜的黏附、侵袭及血管生成密切相关。

总之，本研究结果显示uPA mRNA及蛋白在EMs患者异位内膜与在位内膜的腺上皮、间质细胞中呈高表达，一方面激活纤溶酶降解细胞外基质及基底膜，使异位内膜细胞更易侵袭及转移；另一方面uPA mRNA及蛋白在EMs患者异位内膜与在位内膜的血管内皮细胞细胞中表达，诱导微血管的形成为异位内膜的黏附提供营养。二者共同促进EMs的形成，为EMs的发病机制拓展一条新的思路，更为寻找EMs有效的药物治疗靶点提供依据，但uPA在EMs的发病机制中的具体作用仍不清楚，本课题组下一步希望通过uPA的激活剂及抑制剂干预EMs患者在位内膜腺上皮细胞后采用Transwell、RT－PCR、Western blot等试验方法检测uPA蛋白、mRNA的表达及细胞侵袭性的变化进一步验证uPA在EMs发生、发展中的作用。

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