四物汤治疗更年期综合征的作用机制研究

陈 悦，冯 放，裴育莹，俞舒丹，梁叶莺，赵丕文

(北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

论 著

四物汤治疗更年期综合征的作用机制研究

陈 悦，冯 放，裴育莹，俞舒丹，梁叶莺，赵丕文

(北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

目的 观察四物汤对更年期模型SD大鼠的作用并探讨发挥作用的可能靶点和机制。方法 将正常SD雌性大鼠40只按体质量均衡和随机的原则分为正常组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组。除正常组外,其余组均切除两侧卵巢造模。手术2周后,正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组分别给予3，6,9 g/(kg·d)四物汤灌胃,均1次/d,持续6 d。第7天腹主动脉取血并分离血清，分离子宫并称质量，免疫组化法测定子宫组织雌激素受体ERα表达量；蛋白质免疫印记技术检测药物血清对T47D细胞雌激素受体ERα表达的影响。结果 正常组大鼠的子宫系数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组的子宫系数与模型组比较差异均有统计学意义，且随着四物汤方剂浓度的升高，子宫系数有增大的趋势；大鼠子宫组织ERα表达模型组与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)，四物汤中剂量组和高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；四物汤低、中剂量组的含药血清能够明显提高T47D细胞ERα的表达水平(P均<0.01)。结论 四物汤对更年期综合征有很好的治疗作用，并可提高靶细胞ERα的表达水平。

四物汤；更年期综合征；子宫系数；T47D细胞；ERα

更年期妇女最突出的症状是绝经，同时伴有一系列的生理和心理变化[1]。当今社会生活节奏急速加剧，竞争也越来越激烈，更年期妇女处在生活变化、事业发展和家庭负担等多重压力下，越来越多的妇女出现更年期综合征的典型症状，而更年期症状的轻重直接影响到更年期妇女的身体健康和生活质量[2]。所以对更年期综合征的发病机制及其治疗的研究显得尤为重要。 现在性激素治疗被认为是临床最有效的方法，但是其不良影响有待进一步研究[3]。而且此病病程长，病变涉及脏器广，患者的个体差异大，临床症状多样化，单纯采用性激素难免以偏概全，加之激素应用的局限性和不良反应，性激素治疗的推广和使用受到限制[4]。近年来，中医发挥其整体观念、辨证论治的特点，在更年期综合征的辨证分型、治疗用药等方面取得了一定的进展，对更年期综合征的临床研究有一定的指导意义[5]。 四物汤作为中医药学的经典方剂，用于治疗更年期综合征取得了很好的效果[6]，但其发挥药理作用的途径和机制尚待揭示。本研究观察了四物汤对更年期模型SD大鼠的作用，并利用雌激素受体阳性T47D细胞探讨其发挥作用的可能靶点和机制。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1动物 SD大鼠40只，雌性，出生后28 d，体质量120 g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2011-0004。实验期间饲养在三级动物室，温度(25±1)℃。

1.1.2实验用药物 熟地黄、当归、白芍、川芎均购自北京同仁堂中药店。药材经浸泡、煎煮、浓缩等处理使药物终质量浓度含生药量2 g/mL，所得药液置4 ℃冰箱保存备用。

1.1.3实验用试剂 改良型1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SDS-聚丙烯酞胺凝胶(北京康为世纪生物科技有限公司)，甲醇(北京化工厂)，PVDF膜(Millipore Immobilon)，脱脂奶粉、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光剂、PBS-T缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司)，雌激素受体(ER)α抗体(Santa Cruz公司)，小鼠抗β-Actin单抗、山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记、山羊抗兔IgG/辣根酶标记、免疫组化试剂盒(中杉金桥产品)，X光感胶片(柯达)，DAB显色试剂盒、细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.4细胞株 人乳腺癌T47D细胞购自北京协和医科大学细胞中心。

1.1.5仪器 电子读数分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，普通手术器械，培养箱(SANYO,MCO218A IC)，酶联免疫检测仪(Tecan)，显微镜(Olympus)，高速离心机(博劢行仪器有限公司)，电泳系统(Bio-Rad)。

1.2分组及造模、给药 将动物按体质量均衡和随机的原则分为正常组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组。40只SD大鼠适应性饲养1周，于第8天戊巴比妥钠麻醉，模型组和四物汤各组摘除两侧卵巢造模：在大鼠背部皮层剪开一个约1 cm长的开口，小心分离皮层和肌肉层，找到卵巢位置，在脊柱两侧肌肉层各剪开一约0.5 cm的开口，找到两侧卵巢并分离，在靠近卵巢处和距离卵巢约0.1 cm的输卵管处分别结扎，然后用剪刀在两个结扎处中间剪断并将卵巢取出，之后用50 ℃的生理盐水将开口冲洗干净并分别缝合肌肉层和皮层，最后用碘伏消毒伤口。手术2周后，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组分别给予3，6,9 g/(kg·d)四物汤灌胃,均1次/d,持续6 d。

1.3取材 各组动物于最后给药后第2天称质量，乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，4 ℃存放过夜，3 000 r/min离心10 min，小心分离血清，-20 ℃贮存备用；同时分离、剪下子宫，称质量后立即浸入10%福尔马林溶液中固定备用。

1.4子宫组织ERα和ERβ免疫组化法染色观察 子宫组织称质量后，立即放入4%多聚甲醛中，固定过夜，按常规方法对已固定的组织进行脱水、透明、石蜡包埋，5 μm切片，应用SP试剂盒进行免疫组化法染色，封片，镜下观察，测定灰度值，分析ERα的表达量。

1.5细胞培养 人乳腺癌细胞T47D常规培养在含10%胎牛血清的改良型1640培养基中，培养条件为37 ℃，5%CO2，相对饱和湿度。

1.6蛋白质免疫印记(Western blot)检测 ①蛋白提取及浓度测定:T47D细胞传代3次，选取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清改良型1640培养基，接种于6孔板内，每组6孔，每孔培养液总体积为1 mL培养24 h待细胞贴壁后，换为含10%含药血清的改良型1640培养液中继续培养。将各组在含10%含药血清的改良型1640培养液中培养的T47D细胞放置于冰上，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入适量细胞裂解液，待细胞裂解后，4℃，12 000 r/min离心，吸取上清液，-80 ℃保存备用。BCA试剂盒测定各组蛋白的浓度。②SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE):取30 g蛋白与等体积4倍上样Buffer混匀后，100 ℃变性10 min。蛋白样品进行不连续SDS-PAGE分离，5%浓缩胶、12%分离胶。80 V电泳20 min，待条带迁移至分离胶上缘时调整为120 V电泳80 min。③转膜:PVDF膜先用甲醇浸泡30 s，再用转膜缓冲液浸泡30 min，采用湿转法进行电转移，100 V，75 min。转膜结束后考马斯亮蓝对SDS-聚丙烯酞胺凝胶染色，观察条带。④封闭:室温下在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中于脱色摇床上轻轻摇动封闭1.5 h。⑤一抗孵育:室温下抗雌激素α一抗(1∶500倍稀释)10 mL在平皿中于脱色摇床上轻轻摇动孵育2 h,然后用TBST(含200/a Tween20)缓冲液摇床摇动洗膜3次，每次10 min。⑥二抗孵育:二抗1∶1 000稀释，同上述方法室温孵育1 h，洗膜。⑦显色:加ECL发光剂作用2 min，在暗盒中于X射线片上曝光1 min，显影、定影，在底片上有蛋白处显示黑色曝光斑，胶片洗涤干燥。

2 结 果

2.1各组大鼠子宫系数比较 模型组子宫系数明显低于正常组(P<0.01)，四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组的子宫系数均高于模型组，且随着四物汤方剂浓度的升高，子宫系数有增大的趋势。四物汤中剂量组子宫质量高于模型组(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠子宫系数比较

注:①与正常组比较,P<0.01；②与正常组比较，P<0.05；③与模型组比较,P<0.01。

2.2各组大鼠子宫组织ERα表达情况 正常组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组、四物汤高剂量组子宫组织ERα表达量分别为(100.0±12.0)%,(69.4±17.8)%,(75.6±6.5)%,(93.1±18.6)%,(91.3±14.3)%。模型组子宫组织ERα表达量明显低于正常组(P<0.01)，四物汤中剂量组和四物汤高剂量组子宫组织ERα表达量明显高于模型组(P均<0.05)。

2.3各组T47D细胞ERα表达情况 正常组、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组(四物汤高剂量组药物血清培养的T47D细胞因从中所提取的蛋白浓度过低，无法进行蛋白质免疫印记检测，故不参与本实验结果讨论)T47D细胞ERα表达量分别为(0.536±0.099)%,(0.393±0.067)%,(1.183±0.165)%,(0.855±0.084)%。四物汤低、中剂量组T47D细胞ERα的表达水平明显高于模型组和正常组(P均<0.01)。蛋白质免疫印记检测结果见图1。

1为正常组；2为模型组；3为四物汤低剂量组；4为四物汤中剂量组。

3 讨 论

目前研究更年期综合征最常用的动物模型制造方法之一是卵巢摘除法，此方法不仅可显示更年期激素水平和神经递质的变化，还可作为反映伴随更年期的其他症状的模型，可以突出所研究药物的特点，而且此法造模时间短，成功率高，重复性好，模型稳定[7]。所以本实验采用了这一常用的动物模型制造方法。结果表明，模型组大鼠子宫质量、子宫系数、子宫组织ERα表达率、T47D细胞ERα表达率均低于正常组。

四物汤是治疗血虚证首选的名方，由熟地、川芎、当归、白芍组成，熟地为君滋阴养血，填精补髓；辅以当归，补血养肝，活血调经；佐以白芍，和营养肝；使以川芎，活血行滞。现代实验研究表明，四物汤具有补血、免疫调节、降血脂、调节子宫活动、抗药物毒性等作用，并且四物汤的药理作用与其各组分的用量有关[8]。郝庆秀等[9]的实验结果表明，四物汤未表现出促进幼鼠子宫质量增加的作用。而在本实验条件下，四物汤对更年期大鼠有促进子宫质量增加的作用，且与剂量大小有关系。之所以存在差异可能与动物模型、四物汤中药的配伍、四物汤灌胃剂量等有关。

子宫组织中ER的水平直接影响着体内性激素对靶器官的作用，ERα分布广泛，在子宫腔上皮细胞、间质细胞、肌细胞和腺上皮细胞均有表达[10]。雌激素与相应的ER亚型α和/或β结合后通过调节基因转录，即与靶基因启动子序列内的雌激素应答元件(ERE)结合，进一步调控相应靶基因的表达而发挥生物学效应[11]。植物雌激素因结构与雌激素相近，故也可通过与靶细胞雌激素受体亚型的相互作用而发挥雌激素或抗雌激素作用。本研究结果显示，四物汤可上调更年期模型大鼠子宫组织ERα表达，表现出植物雌激素样作用，这与郝庆秀等[12]研究结果一致。蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段[13]，该技术能弥补免疫组化非精确定量的弱点[14]，更加准确直观地反映细胞中ERα的表达量。本研究显示四物汤低、中剂量组的含药血清能够明显提高雌激素依赖肿瘤细胞T47D细胞ERα的表达水平，其结果与免疫组化结果相一致，证明四物汤可能是通过上调靶器官ERα表达而发挥治疗更年期综合征的作用。近几年的研究表明金雀黄素、芹菜素、异补骨脂素和蜕皮甾酮均可促进T47D细胞增殖，而且主要经ERα介导[15-16]，与本实验中四物汤的作用结果一致。同时，赵丕文等[16]和沈丽霞等[17]研究发现，异补骨脂素、懈皮素等中药活性成分均可通过ER途径或ER亚型调节功能发挥对乳腺癌细胞增殖的干预作用。但是由于本研究选取了ERα，ERβ即双阳性且两者表达程度较为相近的T47D细胞为实验材料，所以尚不能排除四物汤对更年期综合征的治疗亦通过上调靶器官ERβ的表达或通过调节两种ER亚型的表达比例起作用，所以对于四物汤治疗更年期综合征的机制还需进一步深入研究。

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Study on the mechanism of Siwutang decoction in the treatment of climateric syndrome

CHEN Yue, FENG Fang, PEI Yuying, YU Shudan, LIANG Yeying, ZHAO Piwen

(Basic Medical College of Beijing University of TCM, Beijing 100029, China)

Objective It is to observe the effect of Siwutang decoction on climateric syndrome in SD rat models and to explore the possible target point and mechanism. Methods Forty female SD rats were randomly divided into five groups: normal group, model group and low, medium and high concentration groups. The rats in all the groups except normal group were resected on both sides of the ovary to establish models. In 2 weeks after operation, normal group and model group was given the same volume of distilled water by intragastric administration, and low, medium and high concentration groups were treated with Siwutang decoction at the dosage of 3, 6, 9 g/(kg·d) respectively once per day and for 6 days. On the seventh day, animals were sacrificed and uteri were separated solely and weighed. The blood was collected, and serum was separated. The expressions of subtypes-estrogen receptor-alpha (ERɑ) on the uteri were detected by immunohistochemical method. The effect of the pharmacological serum on proliferation assay with human breast cancer cell line (T47D) was detected by immune protein imprinting technology. Results There were significant differences in the uterus coefficient between normal group and model group(P<0.01) .The uterus coefficient of three Siwutang groups were different compared with model group, and with the increase of concentration of Siwutang decoction prescription, uterus coefficient increased accordingly. In the expressions of ERɑ on the uteri, there were significant differences between normal group and model group(P<0.01 ) and there were also differences among model group and medium concentration group and high concentration group. Low concentration of Siwutang decoction could increase the expressions of ERɑ in the T47D cells(P<0.01). Conclusion Siwutang has a good effect on menopausal syndrome, and can improve the expression of ERα of target cells.

Siwutang；menopausal syndrome；uterus coefficient；T47D cells； ERα

陈悦，女，研究方向为中西医结合临床。

赵丕文，E-mail:pwzhao@sina.com

国家级大学生创新创业训练计划项目(201310026029)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.001

R588

A

1008-8849(2015)08-0799-04

2014-09-30