黄芩苷对热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70 表达的影响

迟世凯，孙春玲，李华涛，丛 霞，姜忠玲，王 新，曹荣峰，田文儒

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

中兽医认为，高温作为应激因子对机体产生热应激乃至造成热应激综合征，最后往往以肾功能衰竭而死亡[1]。黄芩苷（Baicalin）是从黄芩的干燥根中提取出的一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一，其解热作用显著[2]，Tsai 等[3]研究认为黄芩苷可能通过抑制下丘脑中N-甲基-D-天冬氨酸受体依赖羟基旁路和TNF-α的增加从而发挥其解热作用。目前关于黄芩苷单体解热方面的研究甚少，其解热机制的研究也尚未深入，以黄芩为主药的中药复方解热机制方面的研究也不多，且复方研究结果不能代表单味药。现已证明，多种体外培养的细胞和胚胎受热后均能产生热休克蛋白（HSP），HSP70 是HSPs 家族里含量最多，亦是最重要的一种非特异性细胞保护蛋白，尤其对体外培养的细胞具有显著的抗热保护作用[4-5]。刘萍等[6]研究表明，黄芩苷能够促进大鼠脑缺血再灌注损伤后海马神经元HSP70 的表达，而黄芩苷能否调节热应激条件下的细胞合成HSP70，目前未发现有任何报道。因此，本研究拟探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪肾小管上皮（LLC-PK1）细胞HSP70 表达的影响，以期为黄芩苷的解热作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 黄芩苷，购自北纳创联生物技术研究院；高糖DMEM和胰蛋白酶，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自HyClone 公司；RNA提取试剂盒，购自原平皓生物有限公司；反转录试剂盒、rTaqDNA聚合酶和DL-1 000 Marker，购自TaKaRa公司；LightCycler®480 SYBR Green I Master，购自Roche 公司；HSP70、GAPDH 抗体和兔抗羊IgGHRP 分别，购自Santa Cruze 公司和Jackson ImmunoResearch 公司；BLUeye Prestained Protein Ladder，购自GeneDireX 公司；Western 及IP 细胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL 荧光底物试剂盒，购自碧云天生物制品有限公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank 中收录号为NM001123127的猪HSP70 基因序列和XM003357928猪β-Actin基因序列设计引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列如下：HSP70 Sense primer：5′-GCCCTGAATCCGCAGAATA-3′，Anti-sense primer：5′-TCCCCACGGTAGGAAACG-3′，扩增片段长度为152 bp；β-Actin：Sense primer：5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′，Anti-sense primer：5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′，扩增片段长度为411 bp。

1.3 细胞培养与试验分组 LLC-PK1 细胞为美国ATCC细胞库第3 代细胞，购自上海复祥生物科技有限公司。细胞用含12%胎牛血清的高糖DMEM在37 ℃、5% CO2的饱和湿度下培养，待细胞覆盖率达到80%～90%后传代，传代细胞用于后续试验。

试验分为Ⅰ组37 ℃常温对照组，Ⅱ组42 ℃单纯热应激1 h 组，而Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组和Ⅶ组分别添加0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 不同浓度黄芩苷培养24 h 后再将其42 ℃热应激1 h 组。

1.4 cDNA合成与PCR 扩增电泳 按照RNA快速提取试剂盒（原平皓生物有限公司）说明书，提取各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒（TaKaRa 公司）说明书，进行RT 反应。将合成的cDNA进行PCR 扩增，产物经2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/L 溴化乙锭）电泳，由GDS-8000 凝胶成像分析系统拍照鉴定。

1.5 荧光定量PCR 检测HSP70 基因的表达 将合成的cDNA产物做一系列浓度梯度稀释，使用Roche LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR 仪进行定量分析。反应体系为10 μL，其中包括：ddH2O23.6 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA1 μL。反应条件为95 ℃10 min，95 ℃5 s 和58 ℃30 s，共45 个循环。

1.6 Western Blot 检测HSP70 蛋白的表达 提取细胞总蛋白，混合2×SDS样品缓冲液加热变性后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，4℃条件下220 mA恒流湿转2 h，再封闭2 h，按顺序加入一抗二抗孵育后，用ECL 试剂盒进行化学发光，最后用UVP 凝胶成像系统拍照检测，用AlphaView对试验结果进行灰度值分析。

1.7 数据统计分析 采用SPSS16.0 软件做统计学处理，各组数据进行LSD多重比较，均数间进行t检验。

2 结果

2.1 PCR 扩增 利用设计的HSP70 和β-Actin 引物进行PCR 扩增，在152 bp 处扩增到了一条HSP70 的条带，在411 bp 处扩增到了一条β-Actin的条带，与预期值相符合，经基因测序证实其为目的基因产物。

2.2 HSP70 mRNAReal-time PCR 结果 各组细胞以β-Actin 做内参基因，用2-△△Ct法进行相对定量分析后发现（图1），与37 ℃常温对照组相比，其他各组LLC-PK1 细胞HSP70 mRNA的表达量均升高，其中Ⅵ组和Ⅴ组差异极显著（P＜0.01），其余各组差异显著（P＜0.05）；与42 ℃单纯热应激组相比，除Ⅰ组外，其余各组LLC-PK1 细胞HSP70 mRNA的表达量均升高，其中Ⅴ组差异极显著（P＜0.01），Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ租和Ⅶ组差异显著（P＜0.05）。

图1 各组LLC-PK1细胞HSP70 m RNA相对表达量

图2 HSP70和GAPDH蛋白电泳

图3 各组LLC-PK1细胞HSP70 蛋白相对表达量

2.3 HSP70 蛋白Western Blot 结果 Western Blot检测蛋白表达的结果（图2）用AlphaView软件扫描其灰度，并对数据进行统计分析发现（图3），与37 ℃常温对照组相比，其他各组LLC-PK1 细胞HSP70 蛋白的表达量均升高，其中Ⅴ组差异极显著（P＜0.01），其余各组差异显著（P＜0.05）；与42℃单纯热应激组相比，除Ⅰ组外，其余各组LLCPK1 细胞HSP70 蛋白的表达量均升高，但Ⅲ组和Ⅶ组差异不显著，Ⅴ组差异极显著（P＜0.01），Ⅳ组和Ⅵ组差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

细胞在受到高温、缺氧及重金属等应激源刺激时，细胞过表达HSP70，而HSP70 能够增加细胞自身对损害的耐受力，维持细胞正常功能代谢，提高其存活率[7]。因此，很多研究者尝试过许多方法来增加细胞中HSP70 的表达[8-9]，从而提高细胞抗应激的能力，但在培养液添加中草药的单一成分来提高细胞的HSP70 表达的报道甚少，添加黄芩苷的尚无报道。

据报道黄芩苷具有清热解毒、抗菌消炎、抗氧化、降压，及镇静等作用[10]。而李倩楠[11]曾经报道，高剂量黄芩苷（160 mg/kg）灌服能明显降低发热大鼠的体温，并认为黄芩苷可能通过抑制TNFA和IL-1B的产生或释放，继而引起IL-6 的改变，再使PGE2 合成减少,从而发挥解热作用。赵红艳[12]等研究表明，黄芩苷可以通过降低下丘脑中PGE2 和cAMP 的含量来起到解热作用。

本试验42 ℃单纯热应激1 h 能显著诱导LLC-PK1 细胞HSP70 的表达，说明42 ℃的温度能够引起细胞的热休克反应。与37 ℃常温对照组相比，在LLC-PK1 细胞培养液中添加的黄芩苷在1 μg/mL 以 下（0.01～1 μg/mL）时，细胞表达HSP70 的量随黄芩苷浓度增加而升高，而当黄芩苷浓度在1 μg/mL 以上（1～100 μg/mL）时，虽然细胞HSP70 表达呈降低趋势，但仍显著高于对照组，这说明黄芩苷（0.01～100 μg/mL）能够上调热应激条件下LLC-PK1 细胞HSP70 的表达。与42 ℃单纯热应激组相比，黄芩苷（0.01～100 μg/mL)均能显著增加细胞HSP70 mRNA的表达，但0.01 μg/mL 和100 μg/mL 黄芩苷对细胞HSP70 的蛋白表达无显著性影响，首先，有研究表明[13]，真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔，转录和翻译还受到多种因素调控，因此mRNA的表达水平并不一定代表蛋白的表达水平；其次，极有可能因为0.01 μg/mL 的黄芩苷浓度太小，不足以诱导热应激条件下细胞HSP70 蛋白的表达，而100 μg/mL 的黄芩苷的浓度又过大，抑制了热应激条件下细胞HSP70 蛋白的持续高表达，所以，试验成功筛选出黄芩苷诱导热应激条件下LLCPK1 细胞HSP70 表达的最佳浓度范围，即0.1～10 μg/mL，且1 μg/mL 的黄芩苷诱导效果最显著。

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