氧化亚铁硫杆菌固定化技术及其应用

廖泽君 史文革(南华大学核资源工程学院，湖南 衡阳 421001)

氧化亚铁硫杆菌固定化技术及其应用

廖泽君 史文革(南华大学核资源工程学院，湖南 衡阳 421001)

氧化亚铁硫杆菌是一种重要的浸矿细菌，细胞固定化技术能将该菌限定在特定的区域内，增加细菌密度，有效提高其对Fe2+及低价态硫的氧化能力，且能提高细菌的稳定性和机械强度，并简化浸矿生产条件，最终提高工业生产的经济效益。该技术运用的材料包括有机材料、无机材料和人工合成材料；涉及到的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法、新固定化法等。固定化氧化亚铁硫杆菌技术在生物浸矿和生物脱硫领域具有良好的应用前景，该技术的发展为其实现产业化奠定了基础。

氧化亚铁硫杆菌 浸矿 固定化 载体 脱硫

然而，游离态的A.f菌的密度和氧化活性均较低，增殖速度和对Fe2+、S、S2-的氧化速率也较缓慢；较低的反应稳定性和机械强度使得其对生物反应器的性能要求较高；循环利用困难；自身代谢周期长等限制了其工业应用[8]。针对这些难题，各国科研工作者做了大量研究，由此A.f菌的细胞固定化技术得到了较广泛探究。

1 细胞固定化技术

细胞固定化是用特定的方法将游离状态的细胞限定在特定的区域内，并保持该微生物原有的各种特性，且有利于该微生物重复利用的技术[9]。20世纪60年代开始固定化酶的研究，到20世纪70年代逐渐应用到细胞的固定化研究。目前，细胞固定化已是一项在工业上得到广泛应用的重要技术。

与将游离微生物用于工业生产相比，固定化微生物有以下特点[10]：①密度增加，从而增加反应速率、提高生产能力；②稳定性、机械强度明显提高；③有更高的酶稳定性，有利于反应连续化；④提高次生产物的合成和积累，进一步提高产品生产效率；⑤可在高稀释率的情况下进行操作，而不产生流失现象；⑥能长时间保持细胞活力，并反复利用；⑦能简化设备，优化工艺流程，生产条件更加简单，产品易分离，降低成本[11]。

1.1 细胞固定化方法[12]

1.1.1 吸附法

吸附法包括物理吸附法和离子吸附法[13-14]。利用吸附载体与细胞之间的相互作用力，使细胞吸附在载体表面和内部形成生物膜。这种方法操作简便，条件温和，活性损失小，载体成本低，但是细胞与载体之间作用力小，当外部环境变化较大时细菌容易脱落[15]。常用载体有活性炭、木屑、聚氨酯泡沫、金属丝网、硅胶、离子交换树脂、硅藻土、多孔玻璃、陶瓷、中空纤维等[16]。

1.1.2 包埋法

包埋法[17]是将细胞包在不溶于水的凝胶或者半透膜聚合物的超滤膜内，在保证细胞不泄露的前提下，便于溶液进入、产物排出的细胞固定法。使用前一种材料叫凝胶包埋法，使用后一种材料半透膜包埋法[18]。该方法简单、条件温和、稳定性好、细胞容量高，并可以根据不同的应用将固定化的微生物制成各种形状，是应用最广的细胞固定化方法[19]。其固定化载体材料主要有卡拉胶和海藻酸钠，其次是琼脂、明胶、聚丙烯酰胺、海藻酸钙、角叉菜聚糖等。

1.1.3 共价结合法

共价结合法是通过共价交联将细胞与载体表面的基团形成共价键而固定生物细胞的方法[16]，通常将细胞直接连接到已活化的有机载体或者无机载体上。细胞与载体之间的结合能力强，固定细胞在使用过程中不易脱落，但是其反应条件苛刻，细胞易失活甚至死亡，且可操控性难[20]。常用的载体有硅胶、陶瓷、琼脂糖珠等。

1.1.4 交联法

交联法[21]分为物理交联法和化学交联法，不需要载体，是用特殊的交联试剂，通过物理或化学作用使细胞表面的反应基团相互交联成网状结构，从而固定细胞体的方法。常用的交联剂有醛类(如戊二醛)、胺类(如双重氮联苯胺)、水合金属氧化物、甲苯二异氰酸、甲苯二异氰酸酯等。该方法使细胞之间空隙较小，但相当数量的交联剂有毒性，致使细胞失活率较大，通常与包埋法结合起来使用。

1.1.5 新固定化法

新固定化法[22]是针对不同的工业生产要求而发展起来的一些新方法，包括超微载体法、复合固定法和膜固定法。超微载体法的固定化基质尺寸仅有几百纳米，没有空隙也就不会发生内扩散，且固定化微生物的活性高；复合固定法[23]主要有吸附-包埋法、包埋-交联法、吸附-包埋-交联法等，将2种或2种以上的传统固定法结合起来，能克服传统单一固定化法所存在的缺点，且能提高固定化微生物的生物性能[24]；膜固定法应用较多，能很大程度上提高工艺中传质能力，但是膜不稳定，不利于循环使用。

1.2 固定化载体

固定化载体材料的选择与制备是A.f菌固定化技术的关键。符合工业生产要求的理想固定化载体应有以下特性[25]：①对微生物无毒副作用，不影响细胞活性；②渗透性较好，不影响微生物代谢速度；③机械强度好，能保持微生物稳定性；④能长时间循环使用，不被溶解，且固液分离简单；⑤固定化工艺简单，经济成本低[26]。固定化载体分为有机材料、无机材料和人工合成材料。

1.2.1 有机材料

可用作固定化载体的有机材料有胶原蛋白、淀粉、甲壳素、醋酸纤维素、海藻酸钠凝胶、海藻酸钙凝胶、琼脂、明胶、卡拉胶、角叉菜胶、纤维素、壳聚糖等。这类材料对细胞无毒，传质性能佳，固定化操作简单，且可以制成各种形状大小[27]。但是有些材料强度低、且有可能被细胞或溶质溶解。其中，最常用的材料海藻酸钠与交联剂生成的海藻酸盐很容易被溶解，因此海藻酸钠通常和其他一些材料(如壳聚糖、聚乙烯醇等)制成复合材料来固定化A.f菌[28]。

张爽等[29]采用海藻酸钠固定化包埋A.f菌，制备海藻酸钠-氯化钙固定化凝胶小球。试验通过测定Fe2+的氧化率，并分组筛选海藻酸钠、氯化钙及细胞的浓度，得出A.f菌固定化凝胶小球的最佳制备条件是：海藻酸钠溶液的浓度为 0.025 g/mL、细胞浓度为1.2×107cell/mL；交联剂中氯化钙的浓度为0.02 g/mL。固定化操作过程简易，小球直径均匀，机械强度高，不黏连，稳定性好，有很好的应用价值。

1.2.2 无机材料

可用作固定化载体的无机材料有沸石、陶瓷、煤矸石、高岭土、活性炭、氧化铝等[30]。这些无机材料多数具有很多空隙，能通过吸附作用和静电力将与其接触的细胞固定在材料上。固定化工艺过程较为简单，细胞容量较高，而且载体可以循环利用，但是细胞结合时间短，在流动性反应器中固定化易被破坏[27]。

李志章等[31]以沸石为填料固定化A.f菌，在空气量为0.5 m3/h、循环液体流量为1.0 L/h、培养基初始pH=2.0、Fe2+初始浓度为8 g/L左右的条件下，固定化细胞只需10 h就能使Fe2+的氧化率达到95% 以上，其对Fe2+的平均氧化速率高达0.88 g/(L·h)；而游离细胞对Fe2+的平均氧化速率仅为0.08 g/(L·h)。黄亚洁等[32]选择木屑和圆柱状活性炭固定A.f菌，并制作固定床生物反应器。结果表明，固定床反应器容积为0.65 L，木屑尺寸为12 mm×5 mm×1 mm，在通气速率为1.4 L/min、稀释率为1.1 h-1时，Fe2+的最大平均氧化速率为5.83 g/(L·h)。

1.2.3 人工合成材料

由于单一的有机材料或无机材料有不可避免的缺点，人工合成材料成为科研工作者研究的主要方向，这类材料主要包括人工高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚氯乙烯、聚氨基酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇等)和由多种材料结合而成的复合材料(如海藻酸钠-二氧化硅复合水凝胶、海藻酸钠-聚乙烯醇混合水溶胶、海藻酸钠-聚丙烯酰胺等)。这些材料发挥每种组合材料的优点，形成优势互补，在细胞固定化技术领域前景良好。

张赫[33]用海藻酸钠-聚乙烯醇复合水溶胶混合A.f菌，用硼酸为凝固剂制成固定化颗粒，在摇瓶中pH=1.8时，固定化颗粒对Fe2+的氧化速率最快，固定化颗粒的稳定性良好；固定化小球在生物反应器中稀释率为0.6 h-1、通气量为700 mL/min时Fe2+氧化速率最高为2.912 g/(L·h)，平衡时Fe2+氧化速率为1.236 g/(L·h)，反应器中铁矾沉淀较少。

2 氧化亚铁硫杆菌固定化技术的应用

2.1 氧化亚铁硫杆菌固定化技术在浸矿领域的应用

A.f菌是最主要的浸矿微生物，主要是利用其独特的氧化能力所生产的Fe3+和H2SO4将矿物氧化成可溶的硫酸盐[34]。Fe3+氧化矿物被还原成Fe2+，Fe2+又被A.f菌氧化成Fe3+再继续氧化矿物，这样构成一个氧化还原的浸矿循环。该菌可应用于低品位铜、铀、金、锌、钴等金属矿的浸出生产[35]。将A.f菌固定化，生产Fe3+用于化学浸出，可以提高浸矿效率，缩短浸矿周期，节约浸矿成本、提高经济效益。

陶敏慧[36]利用聚氨酯泡沫为载体固定A.f菌和西伯利亚硫杆菌生产Fe3+，用以浸出难浸高砷金矿。试验结果表明，利用聚氨酯泡沫固定化技术可大幅度提高细菌对Fe2+的氧化速率，在温度为50 ℃，通气量为4 L/min的条件下，固定化微生物在5 h内对浓度为10 g/L的Fe2+的氧化率为95%，约是相同条件下，接种量为10%的该游离菌摇瓶试验反应时间的1/7；酸性硫酸铁溶液浸出高砷金矿的速率优于游离细菌的直接浸矿体系，70 ℃、10 g/L的酸性硫酸铁溶液连续浸出高砷金矿，4 d内砷的浸出率达到71%；高砷金矿采用固定化微生物浸出工艺处理效果更好。

王银梅[37]选用有机塑料瓶盖为填料载体，通过吸附法将A.f菌与氧化硫硫杆菌的混合菌固定化，在自制的生物反应器中进行硫化铜矿生物浸出试验，固定化混合菌18 d时的铜浸出率达45.23%，对应的最佳浸矿系统参数为矿浆浓度10%、细菌接种量10%、浸矿pH=2、矿石粒度为-75 μm。

2.2 氧化亚铁硫杆菌固定化技术在脱硫领域的应用

用固定化A.f菌的产物Fe3+间接氧化并脱除SO2和H2S，不仅脱除率高、不产生污染物，而且投入成本低，有利于我国环境的保护，符合可持续发展的国策。

刘晓伟[38]用活性炭为载体固定化A.f菌，并制作滴滤塔处理SO2废气，在温度为 25～30 ℃时，进气口SO2质量浓度小于1 740 mg/m3，气体在反应器中停留时间为 80 s 左右，循环营养液中Fe2+浓度高于2.6 g/L，循环营养液流量0.9 L/h 左右的条件下，SO2去除率达到 90% 以上。

苏峰[39]采用新型固定化载体通过吸附法固定A.f菌，并制作生物-化学反应器进行脱H2S研究，在通气量为125 L/h、稀释率为0.43 h-1条件下，固定化系统的氧化速率最高，达3.205 g/(L·h)；当Fe3+浓度为8 ～ 12 g/L、气速为40 ～ 60 mL/min时能达到最佳的脱硫效果。

3 结论与展望

(1)从A.f菌被发现到其固定化技术的发展，国内外科研工作者做了大量研究。固定化A.f菌作为生产Fe3+的主要微生物氧化剂，由于A.f菌固定化技术简单、细菌可重复利用以及生产成本低等优点，因此固定化A.f菌在环境治理、微生物浸矿等领域展现了良好的发展前景。

(2)A.f菌固定化技术目前尚不成熟，多数工作还处在室内试验或半工业试验探索阶段。载体的无毒性、优良的渗透性及机械强度、小成本、高循环利用率及其简单固定化工艺等方面还需要做更多更深入的探究，这是决定这项技术在未来发展的首要问题。随着针对这些问题的生物学、材料学研究的深入，A.f菌固定化技术会完全实现工业生产。

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(责任编辑 罗主平)

Immobilized Technology of Acidithiobacillus Ferrooxidans and Its Application

Liao Zejun Shi Wenge(CollegeofNuclearResourcesEngineering,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

Acidithiobacillusferrooxidansis an important bacteria for ore-leaching.Cell immobi-lized technology can limit the bacteria within a particular region,increase the density of bacteria,effectively increase the oxidability on Fe2+and low-valent sulfur,improve the stability and me-chanical intensity,simplify the conditions of production,and ultimately improve the economic benefits of industrial production.Materials used by this technique include the organic materials,inorganic materials and artificial synthetic materials.Immobilized methods involved include adsorption method,embedding cross methods,cross-linking methods,new immobilization methods,et al.The immobilized technology has a good application prospect in the field of bioleaching and bio-desulfurization,development of which establishes the foundation for realizing its industri-alization.

Acidithiobacillusferrooxidans,Ore-leaching,Immobilization,Carrier,Desulfurization

2014-10-22

廖泽君(1990—)，男，硕士研究生。通讯作者 史文革(1967—)，男，教授。

TD925.5

A

1001-1250(2015)-01-062-05