应用行为学模型研究水杨酸致大鼠耳鸣的主要产生部位

张恩柱宋为明鄢开胜汤凌浩崔万明

·实验研究·

应用行为学模型研究水杨酸致大鼠耳鸣的主要产生部位

张恩柱1宋为明2鄢开胜1汤凌浩1崔万明1

目的 通过建立跳台反射法耳鸣动物行为学模型，探讨水杨酸致大鼠耳鸣的主要产生部位。方法40只健康Wistar大鼠，随机分为实验组和对照组，每组20只。两组动物分别建立跳台反射行为学模型后，实验组经腹腔注射水杨酸钠完成耳鸣动物造模，对照组腹腔注射等量生理盐水；造模成功的实验组动物行双侧听神经切断术后，再次腹腔注射水杨酸钠，通过动物跳台反射行为测试再次判断实验组动物是否仍有耳鸣产生；对照组动物不行双侧听神经切断术，其余实验步骤同实验组；比较两组动物平均每10次刺激间隔期出现假阳性反应的次数。结果 与对照组相比，实验组动物双侧听神经切断、注射水杨酸钠2小时后，在无声音刺激条件下单位时间内出现跳台动作频数明显减少，平均每10次刺激间隔期出现的假阳性反应为1.59±0.12次，与对照组（2.69±0.78次）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 双侧听神经切断术后水杨酸钠注射不能使大鼠产生耳鸣，说明听觉外周是水杨酸导致大鼠产生耳鸣的关键部位。

耳鸣； 动物模型； 跳台； 水杨酸钠； 听神经切断

水杨酸类药物对人体具有明显的耳毒性，长期大剂量应用会导致机体出现可逆性高调性耳鸣及听力下降。有研究认为［1，2］，水杨酸对耳鸣动物造成的病理损害主要在外周听觉系统，特别是耳蜗基底回的外毛细胞［1］。近年来，有许多研究发现，水杨酸可引起耳蜗神经、耳蜗核及颞皮层等蜗后中枢听觉系统神经元兴奋性的异常改变［3，4］。本研究拟通过跳台反射法建立耳鸣动物行为学模型，观察水杨酸

钠使正常大鼠产生耳鸣的行为学证据，并进一步通过观察听神经切断大鼠注射水杨酸钠后的行为学改变，探讨水杨酸致大鼠耳鸣的可能产生部位及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性白色Wistar大鼠40只，耳道清洁，耳廓反射灵敏，对电刺激反应敏感，体重265～420 g，平均358 g（由大连医科大学实验动物中心提供）。将动物随机分为实验组和对照组，每组20只。

1.2 主要试剂与仪器 水杨酸钠（美国Sigma公司）；专用屏蔽训练箱（自制）；大鼠跳台仪（北京药物研究所，DTT-2型）。

1.3 实验方法

1.3.1 建立条件反射 参考Guitton等［5］建立的跳台反射模型建立“声刺激-跳台逃避”的条件反射动物行为学模型。条件刺激为外界声音刺激（10 k Hz，60 d B SPL），持续时间5秒，非条件刺激为给予动物足底电击（5 m A），持续时间15秒，条件刺激和非条件刺激出现的时间间隔为2秒，每10次训练为1个训练序列。训练过程中，动物受到声刺激后，因足底受到持续电击而产生向绝缘跳台跳跃的逃避反应，分别记录动物在给声期间及刺激间歇期（无声期）是否出现跳台行为反射。经过2～4天的适应性训练，动物开始将“声信号”和“电击”相联系，并逐渐建立“声刺激-跳台逃避”的条件反射，连续4天未学会跳台逃避的动物即被淘汰（9只）。正确反应率（R）为给声期间动物正确跳上跳台的百分率，当每只动物至少在连续3组训练序列中对声音的正确反应率≥80%即判定为条件反射建立成功。

1.3.2 耳鸣动物造模方法及动物行为监测 31只成功建立条件反射的动物继续进行耳鸣动物造模实验，观察实验不同阶段动物的行为反应。其观测指标为：假阳性反应（FP），即平均每个训练序列（每天共10次训练）中动物在声刺激间隔期（外界无声刺激）的前1 min内出现跳台逃避行为的次数。

给药方法及行为监测分为以下2个阶段：

手术前：观察并记录给药前2天（第1，2天）实验组（n＝16）和对照组（n＝15）动物的假阳性反应次数；然后，两组动物分别每日经腹腔注射10%水杨酸钠和生理盐水350 mg／kg，连续给药4天（第3～6天），每次给药后2小时进行动物跳台反射行为测试，观察两组动物给药期的行为反应变化；停药后继续观察并记录5天（第7～11天）两组动物的行为反应。

手术后：实验组动物经双侧听神经切断后，术后恢复2天后，观察并记录给药前2天（第1，2天）实验组（n＝12）和对照组（n＝11，只做切口，不切断双侧听神经）动物的假阳性反应次数；然后，两组动物均连续4天（第3～6天）经腹腔注射10%水杨酸钠（350 mg／kg），观察给药期间两组动物的行为学变化；停药后继续观察并记录5天（第7～11天）两组动物的行为反应。

1.3.3 双侧听神经切断手术 实验组大鼠完成手术前给药及行为观察后，经2%戊巴比妥钠麻醉后手术区备皮，消毒后行耳后切口，长约1～1.5 cm。显微镜下暴露并打开听泡外侧壁，打开耳蜗底回，近内耳门处仔细切断听神经；用可吸收明胶海绵填塞耳蜗，缝合切口，术毕肌肉注射青霉素160万U／kg预防感染。术后24小时后观察大鼠进食情况及爬行姿态，淘汰因手术死亡、术后进食欠佳或爬行姿态异常大鼠8只，故术后实验组动物12只，对照组动物11只。

1.4 统计学方法 实验测得数据均经过SPSS 16.0统计软件处理，行Shapiro-Wilks检验符合正态分布，对动物的假阳性反应（PR）行t检验分析。

2 结果

2.1 耳鸣动物造模结果及听神经切断术前大鼠行为观察 经过4～6天的训练和强化，共31只动物（实验组16只，对照组15只）建立了稳定的“声刺激-跳台逃避”条件反射，造模成功率为77.5%（31／40）。

实验组动物经腹腔注射10%水杨酸钠（350 mg／kg）期间假阳性反应明显增加（表1），在给药期动物平均每10次测试中出现的假阳性反应为3.90 ±1.60次，与给药前相比差异有统计学意义（P＜0. 05）；而对照组动物行为无明显变化（P＞0.05）。说明实验组动物注射水杨酸钠后因感受到耳鸣，在外界无声条件下出现频繁的跳台逃避行为，水杨酸钠耳鸣动物模型造模成功。

表1 听神经切断术前给药前后不同时间两组大鼠假阳性反应次数比较（次，±s）

表1 听神经切断术前给药前后不同时间两组大鼠假阳性反应次数比较（次，±s）

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2.2 听神经切断术后大鼠行为观察 实验组双侧听神经切断后，给药期间平均每10次刺激间隔期出现的假阳性反应次数为1.59±0.12次，与给药前及停药后相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；而对照组动物给药期间平均每10次刺激间隔期出现的假阳性反应为2.69±0.78次，与给药前和停药后比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组动物在给药期间出现的假阳性反应频次对比差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。说明实验组听神经损毁大鼠经注射水杨酸钠后并无明显耳鸣产生，对照组动物在应用水杨酸钠后，仍可感受到耳鸣。

表2 听神经切断术后给药前后两组大鼠假阳性反应次数比较（次，±s）

表2 听神经切断术后给药前后两组大鼠假阳性反应次数比较（次，±s）

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3 讨论

水杨酸类药物具有明显的耳毒性，利用其制作耳鸣动物模型具有诱导耳鸣成功率高、操作简单、全身副作用小等优点，因此，该方法是目前最常用、有效的探讨耳鸣发生机制和治疗的方法。1994年，Jastreboff等［6］利用条件反射原理，首次设计并成功建立了饮水抑制法耳鸣动物模型，为耳鸣的发生机理和治疗的深入研究提供了帮助。在此原理基础上，2003年Guitton等［5］建立了跳台反射法耳鸣动物行为学模型，该方法通过将“声刺激”作为条件刺激，并将其与“电击-跳台逃避反应”在时间上进行结合、加强并最终使动物建立“声刺激-跳台逃避行为”的条件反射。条件反射建立后，动物对声音反应敏感，条件反射稳定，不易消退，且动物在6～7天内对声音的正确反应率均可维持在80%以上，因此，较适合应用于时间周期相对较长的耳鸣动物实验。另外，与饮水抑制法相比，跳台反射法动物模型建模过程中对动物的身体状态影响较小，较适合应用于动物身体状态有特殊要求的实验，如本研究中对耳鸣动物进行的手术干预等。因此，本实验采用跳台反射法建立条件反射动物模型并用于动物耳鸣判定，较好地达到了实验观察的目的。值得提出的是，2006年Turner等［7］将动物听觉惊跳反射应用于耳鸣动物模型，在一定程度上避免了实验在建立条件反射过程中对动物状态的影响，简化了建模过程。相信随着该模型实验条件的不断完善，惊跳反射动物模型将成为未来建立耳鸣动物模型的方向之一。

耳蜗形态学研究表明，水杨酸盐耳毒性的主要作用部位在耳蜗，特别是外毛细胞［1］，大剂量应用水杨酸盐可引起外毛细胞在形态上出现一定程度的非坏死性改变。水杨酸钠可致耳蜗螺旋神经节神经元细胞胞体缩小、细胞核固缩、碎裂等改变；长期大剂量应用水杨酸钠将导致螺旋神经节神经元和外毛细胞受损，而内毛细胞无显著改变［8］。分子生物学研究发现，水杨酸钠可使豚鼠耳蜗外毛细胞内钙离子浓度增加，推测细胞内钙离子超载可能是水杨酸盐耳毒性机制之一［9］。另外，尚有许多研究表明，水杨酸导致动物产生耳鸣的过程可能有听觉中枢核团神经元的参与，水杨酸可引起蜗后听觉中枢神经元发生神经电生理改变，胡守森等［10］发现长期注射水杨酸盐导致耳鸣的大鼠听皮层中与中枢可塑性密切相关的Egr-1基因表达可逆性下调，表明听皮层神经元发生了可塑性改变，推测听皮层神经元可塑性改变可能参与了水杨酸致动物耳鸣的形成和发展。

本研究结果显示，跳台反射模型建立成功后，正常大鼠注射水杨酸盐后在声刺激间隔期（无声状态下）出现的跳台动作明显增加，证明水杨酸纳可成功诱导动物产生耳鸣；而听神经损毁后再注射水杨酸钠，实验组与对照组相比，动物在声刺激间隔期出现的跳台动作明显减少（P＜0.05），与给药前及停药后相比，无显著变化（P＞0.05）；提示听神经损毁动物再注射水杨酸后并无耳鸣产生，说明外周听觉系统在水杨酸诱导动物耳鸣的发生中发挥着至关重要的作用，可能是耳鸣产生的主要部位，这与最近的一些研究报道［4］较为一致。水杨酸导致动物产生耳鸣的主要作用部位可能在听觉外周，这也许和药物主要分布和作用部位有关，同时，水杨酸钠导致听觉外周受损必然会导致中枢性核团如耳蜗核、下丘神经元兴奋性的异常改变，导致听觉中枢可塑性的改变，并最终导致听觉中枢对耳鸣信号的感知。

1 Jastreboff PJ.Phantom auditory perception（tinnitus）：mechanism of generation and perception［J］.Neurosci Res，1990，8：221.

2 Ruel J，Chabbert C，Nouvian R，et al.Salicylate enables cochlear arachidonic-acid-sensitive NMDA receptor responses［J］.J Neurosci，2008，28：7313.

3 Wallhausser-Franke E，Mahlke C，Oliva R，et al.Expression of c-fos in auditory and non-auditory brain regions of the gerbil after manipulations that induce tinnitus［J］.Experimental Brain Res，2003，153：649.

4 Stolzberg D，Chen GD，Allman BL，et al.Salicylate-induced peripheral auditory changes and tonotopic reorganization of auditory cortex［J］.Neuroscience，2011，180：157.

5 Guitton MJ，Caston J，Ruel J，et al.Salicylate induces tinnitus through activation of cochlear NMDA receptors［J］.J Neurosci，2003，23：3944.

6 Jastreboff PJ，Sasaki CT.An animal model of tinnitus：a decade of development［J］.Am J Otol，1994，15：19.

7 Turner JG，Brozoski TJ，Bauer CA，et al.Gap detection deficits in rats with tinnitus：a potential novel screening tool［J］. Behav Neruosci，2006，120：188.

8 Feng H，Yin SH，Tang AZ.Blocking caspase-3-dependent pathway preserves hair cells from salicylate-induced apoptosis in the guinea pig cochlea［J］.Mol Cell Biochem，2011，353：291.

9 李树华，韩东一，杨伟炎，等［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2002，37：47.

10 胡守森，黄治物，吴皓，等.水杨酸盐诱发大鼠听皮层中Egr-1基因表达的改变［J］.听力学及言语疾病杂志，2012，20：561.

（2014-08-15收稿）

（本文编辑 周涛）

Studies on the Site of Tinnitus Genesis in the Salicylate-Rats Using Animal Behavioral Model

Zhang Enzhu*，Song Weiming，Yan Kaisheng，Tang Linghao，Cui Wanming
（*Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian，106011，China）

Objective To establish an animal behavioral model of tinnitus with step-down test，and make use of the model to analyze the tinnitus genesis site in the salicylate-rats.Methods Forty wistar rats were includscl in this study，they were randonly into 2 groups（experinent group and constrot group，20 rats each group）.Ascertain that the animals treated with sodium salicylate（SS）have the sensation of tinnitus with the method of step-down test behavioral model.After having established a behavioral conditioned reflex，subjects responded correctly to jump onto a climbing pole after hearing the sound.Then animals were under bilateral auditory nerves section，to test whether the ablated-animals could still jump onto the pole after being treated with SS.Results Animals with the ablating surgery could seldom jump onto the pole，only reaching 1.59±0.12 times average per 10 tests.Compared with control group，there were significant differences with t-Test（P＜0.05），suggesting that subjects could not hear the tinnitus after the surgery.Conclusion Sodium salicylate could not make the animals with bilateral auditory nerves section to have the sensation of tinnitus.The peripheral auditory system plays an extremely important role in salicylate-induced tinnitus.

Tinnitus； Model，animal； Step-down； Sodium salicylate； Auditory nerves section

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.03.018

时间：2015-3-4 10：26

R764.45

A

1006-7299（2015）03-0284-03

1 大连医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科（大连 106011）；

2 北京大学第三医院耳鼻咽喉头颈外科

张恩柱，男，辽宁人，硕士，主要从事耳科学基础与临床研究。

宋为明（Email：songwm@bjmu.edu.cn）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150304.1026.004.html