六君子汤对皮肤屏障功能障碍小鼠的影响

杨皓然　方　凯　孙晓菲　解宇环

云南中医学院，云南　昆明　650500

实验研究

六君子汤对皮肤屏障功能障碍小鼠的影响

杨皓然方凯孙晓菲解宇环*

云南中医学院，云南昆明650500

【摘要】目的：观察六君子汤对皮肤屏障功能障碍小鼠的影响。方法：采用胶带法复制皮肤屏障功能障碍小鼠模型，观察正常组、模型组和六君子汤给药组小鼠经皮水分丢失量(TEWL)和神经酰胺含量的差异。结果：模型组小鼠TEWL值上升(P<0.01)、表皮神经酰胺含量下降(P<0.05)；六君子汤各给药组能不同程度的降低TEWL值和升高神经酰胺含量。结论：六君子汤可改善皮肤屏障功能障碍小鼠的皮肤机械屏障功能，机制可能与提高表皮神经酰胺含量有关。

【关键词】六君子汤；皮肤屏障功能障碍；经皮水分丢失量；神经酰胺

皮肤屏障包括皮肤的机械屏障、免疫屏障、神经屏障以及其他与皮肤功能相关方面，狭义的皮肤屏障常指表皮，尤其是角质层的机械性屏障[1]。机械屏障直接与外界接触，是机体与外界环境之间的屏障。该屏障对外界物理性、化学性、细菌等微生物损伤具有防护作用，并有助于维持皮肤的完整性，防止体内营养物质、水份等的丢失。皮肤屏障功能的障碍可诱发湿疹、特应性皮炎、银屑病等皮肤疾病。中医临床治疗本类疾病过程中，无论哪一种证型，都应兼顾脾胃，而健脾法是治疗皮肤屏障障碍相关疾病的重要方法。本研究选用益气健脾经典方剂六君子汤，观察其对模型小鼠皮肤机械屏障障碍的影响，以初步探讨健脾方药对皮肤机械屏障功能的作用。

1仪器与材料

1.1动物SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体重18~22g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。合格证号：SCXK(京)2014-0004。

1.2药品与试剂六君子汤：人参36g，茯苓36g，炒白术36g，炙甘草24g，陈皮12g，半夏18g，药材购自昆明市“一心堂”连锁药店，均由中药鉴定教研室张洁老师鉴定为正品。按方中比例水煎、过滤、浓缩制成浸膏，4℃保存；神经酰胺标准品(美国sigma aldrich公司)；胰酶(Lot No：MR28175，法国)；其余试剂均为分析纯。

1.3仪器YLS-Q4 耳肿打耳器(直径为8mm，山东省医学科学院设备站)； HX086146 薄层色谱硅胶板(德国Merck公司)；Vapo Meter测量仪(芬兰Delfin Technologies公司)。

2方法

2.1动物分组及处理将健康ICR小鼠，根据体重分层随机分为5组。即正常对照组、模型组、六君子汤高、中、低剂量组。除六君子汤各组分别灌胃给予不同浓度的的六君子汤水煎液外，其余各组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续13d。除正常对照组外，其余各组从给药第9天起，以胶带法[2]复制皮肤机械屏障障碍模型，连续5d。造模各组于造模前1天，剃去小鼠颈背部被毛。

2.2表皮经皮水分丢失量(TEWL)测定造模第5天，用Vapo Meter测量仪测定小鼠颈背部皮肤TEWL值，室温20～25℃，空气相对湿度50%～60%。测量仪器与测量部位皮肤表面垂直接触，每一测试部位测量3次，读出数值并记录，取其平均值。

2.3表皮神经酰胺含量的测定

2.3.1表皮脂质的提取造模第5天，检测完TEWL值后将小鼠处死，取下颈背部皮肤，用打耳器打成面积约为50mm2大小的皮肤圆片共6片。将所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴1h，4℃冰箱放置过夜后取出，分离表皮，抽提表皮脂质，氮气吹干，-80℃冰箱保存。

2.3.2对照品的制备称取神经酰胺对照品5.0 mg，置5ml容量瓶中，加氯仿适量，振摇溶解，定容后从中精密吸取1ml溶液，加氯仿定容至5ml，即得0.2mg/ml对照品溶液。

2.3.3线性关系考察精密吸取2、4、6、8、10、12、14μl神经酰胺对照品溶液点于薄层板上展开(展开剂为正己烷-乙酸乙酯=3∶1)，晾干后再于氯仿-甲醇-氨水(90∶10∶0.5)中展开；喷洒显色剂于140℃下烘干显色。显色后采集图片并用Image J软件分析，测定灰度值。经计算得到回归方程y=5346.3x+4222.2，R2=0.9973，线性关系良好，线性范围为0.4~2.8μg。

2.3.4神经酰胺含量测定吸取对照品溶液、供试品溶液，按上述条件测定灰度值，最终换算出神经酰胺含量。

3结果

3.1对皮肤TEWL值的影响由表1可知，与正常对照组比较，皮肤屏障功能障碍小鼠TEWL值增加(P<0.01)；与模型对照组比较，六君子汤三个剂量组均能降低TEWL值(P<0.01)。

表1　六君子汤对皮肤屏障障碍小鼠皮肤TEWL值的影响

注：与正常对照组比较，△△P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01。

3.2对神经酰胺含量的影响与正常对照组比较，皮肤屏障障碍小鼠神经酰胺含量降低(P<0.05)；与模型对照组比较，六君子汤高、中剂量组均能增加神经酰胺含量(P<0.05)。见表2。

表2　六君子汤对皮肤屏障障碍小鼠皮肤神经酰胺含量的影响

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05。

4讨论

有学者将皮肤屏障比喻为“砖墙”结构，角质细胞好比“砖”，而细胞间脂质好比“灰浆”，它将角质细胞紧密地连接起来，使皮肤屏障功能正常[3]。细胞间脂质主要是由胆固醇、脂肪酸和神经酰胺以适当的比例组成。研究发现，神经酰胺约占总脂质的50%，是脂质的主要组成成分，在皮肤屏障修复中起主要作用，若除去神经酰胺就能使表皮层屏障功能几近丧失[4]。阻止水分经皮扩散和丢失，这是皮肤最重要的屏障功能之一，TEWL反映的是水从皮肤表面蒸发量，所以是评价皮肤屏障功能的重要指标，TEWL值越高，说明经皮肤散失的水分越多，角质层的屏障功能也越差[5]。

研究采用胶带法破坏小鼠皮肤屏障后，导致小鼠皮肤TEWL值上升的同时表皮神经酰胺含量下降，表明小鼠皮肤机械屏障功能受损。而六君子汤给药后，小鼠TEWL值下降，小鼠皮肤机械屏障功能得以恢复。说明六君子汤能改善小鼠皮肤机械屏障功能，其机制与增加表皮神经酰胺含量有关。

参考文献

[1]Lang C, Kypriotou M, Christen-Zaech S.Pathogenesis of atopic dermatitis[J].Rev Med Suisse. 2010，28(6):860-865.

[2]李军，陈谨萍，吴伽.一氧化氮对小鼠皮肤ABCA12表达及屏障功能的影响[J]. 广东医学，2010，31(12)：1512-1514.

[3]田燕，刘玮.皮肤屏障[J].实用皮肤病学杂志，2013,6(6)：346-348.

[4]胡珍，于春水.皮肤屏障功能的研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版)，2013，7(7)：3101-3103.

[5]赵鑫.TEWL 在评价皮肤屏障功能研究中的应用[J].广东化工，2014，41(14)：133-134.

(收稿日期：2015.09.07)

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)24-0012-02