莱菔硫烷对重症急性胰腺炎大鼠肺组织内血红素加氧酶-1及环氧合酶表达的影响

孔文基

(齐齐哈尔医学院附属第三医院药剂科，黑龙江齐齐哈尔 161002)



·论 著·

莱菔硫烷对重症急性胰腺炎大鼠肺组织内血红素加氧酶-1及环氧合酶表达的影响

孔文基

(齐齐哈尔医学院附属第三医院药剂科，黑龙江齐齐哈尔 161002)

目的 探讨莱菔硫烷对重症急性胰腺炎(SAP)肺组织血红素加氧酶-1(HO-1)及环氧合酶(COX)表达的影响。方法 将72只大鼠随机分为对照组(N组)、SAP模型组(SAP组)和莱菔硫烷组，每组各24只，分别于术后3、6、12 h对各组进行肺损伤评分、检测肺组织湿干比(W/D)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、HO-1 mRNA、COX mRNA的表达量。结果 SAP组的各指标均明显高于N组(P<0.05)；莱菔硫烷组的病理评分、肺W/D值、TNF-α、IL-1β、COX-2 mRNA表达量较SAP组明显降低(P<0.05)，HO-1 mRNA表达量较SAP组明显升高(P<0.05)；相关性分析示HO-1 mRNA表达量与COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β的表达水平呈明显负相关(P<0.05)。结论 莱菔硫烷增加了SAP肺组织中HO-1的表达量从而减轻急性肺损伤，这可能与通过抑制COX表达有关。

重型胰腺炎； 莱菔硫烷； 血红素加氧酶-1； 环氧合酶

早期的急性胰腺炎约15%～30%发展为重症急性胰腺炎，由于病情发展迅速，不仅表现为胰腺组织局部的缺血坏死，而且常常伴有其他多脏器功能的损害，导致全身炎症反应综合征。其中尤以急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征发病率最高也最严重。炎性反应在重症急性胰腺炎所致的急性肺损伤中发挥了关键的作用，尤其是大量炎症介质的产生，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)[1]。环氧合酶2(COX-2)是前列腺合成的一种重要前炎性介质，相关研究证实了COX-2介导了急性胰腺炎及相关肺损伤的炎性反应过程[2-3]，但是具体机制尚未完全阐明。血红素加氧酶1(HO-1)具有抗氧化、抗感染等一系列生物学效应，参与机体的多种病理生理过程，在调控多种急性肺损伤(ALI)炎性介质的基因表达起重要作用[4]，莱菔硫烷对多种疾病的损伤具有保护作用，成为各个领域研究的热点和难点。本研究旨在探讨莱菔硫烷HO-1重症急性胰腺炎大鼠肺组织内HO-1及环氧合酶(COX)的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源 取健康雄性Sprague-Dawley大鼠共72只，体质量220～260 g，由本院动物房提供。术前禁食12 h，自由饮水。

1.2 试剂 牛黄胆酸钠(Sigma公司)，RT-PCR试剂盒(深圳晶美生物公司)，牛血晶素(B&D公司)，莱菔硫烷(Sulforaphane)购于美国LKT公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和模型制作 将72只SD大鼠分为对照组(N组)、SAP模型组(SAP组)、HO-1莱菔硫烷组(莱菔硫烷组)，每组各24只。SAP模型制作，采用传统的5%牛黄胆酸钠法建立SD大鼠SAP模型。实验前12 h内禁食，自由饮水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后逐层开腹，暴露胰腺和十二指肠。用微量泵逆行胆胰管内匀速内注射5%牛黄胆酸钠(1 mL/kg)，约5 min后当观察到大鼠胰腺组织出现弥漫性出血点时，拔出针头，去除血管夹，连续缝合管壁腹腔。N组开腹后仅用棉签轻轻反动胰腺和小肠后关腹，不注射牛黄胆酸钠。莱菔硫烷组于造模后30 min腹腔注射莱菔硫烷10 mg/kg。

1.3.2 检测指标及方法 各组大鼠分别于术后3、6、12 h 3个时间点各取6只大鼠，用10%的水合氯醛腹腔麻醉，并取组织样本进行检测。

1.3.2.1 肺组织病理 开胸取右肺上叶，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片及HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化并进行评分。

1.3.2.2 肺湿干重比测定 取右下肺纱布拭干后称重记为肺湿重(W)，随后放于80 ℃烤箱中，每天称重1次，待重量稳定后记为肺干重(D)，两者的比值为(W/D)。

1.3.2.3 肺组织炎症因子的检测 取左肺液氮速冻组织用于炎症因子(TNF-α和IL-1β)、HO-1和COX-2的检测。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织中TNF-α和IL-1β的表达，操作严格按照试剂盒说明进行，HO-1和COX-2的检测采用实时定量荧光聚合酶链反应(RT-qPCR)方法：采用TRIzol法提取组织总RNA，取等量RNA进行反转录，HO-1上游引物为5′-ATC ATG GCT TGG CCT ACA TTG-3′,下游引物为5′-CAC GGA TGT GCA CCT CCT T-3′，扩增产物长度为107 bp；COX-2上游引物为5′-TCA AAA GAA GTG CTG-GAA AAG GTT-3′,下游引物为5′-TCT ACCT-GAG TGT CTT TGA CTG TG-3′(296 bp)；β-actin上游引物为5′-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA-3′，下游引物为5′-TAG AGC CAC CAA TCC ACA CA-3′，扩增产物长度为300 bp。反转录反应体系 20 μL，其中5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L)1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，M-MLV RTase(200 U/μL)0.5 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL，RNase free dH2O 9 μL，总RNA 4 μL；反应条件为25 ℃×10 min，42 ℃×30 min，95 ℃×2 min。qPCR反应体系20 μL，其中SYBR super-Mix荧光10 μL，模板混合液(上游、下游引物)1 μL，超纯水5 μL，稀释2倍cDNA 4 μL；反应步骤为第1步：95 ℃×8.5 min；第2步：95 ℃×15 s，58 ℃×1 min，循环45次。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织损伤病理学评分 与N组比较，SAP组肺组织结构破坏，肺泡腔内大量渗出液，间质充血、水肿，炎性细胞明显增多，莱菔硫烷组出血、炎性细胞浸润较SAP组明显减轻，各个时间点的肺病理评分结果显示(表1)：SAP组的病理评分明显高于N组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；莱菔硫烷组的病理评分明显低于SAP组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠肺组织湿干重比变化 研究结果发现SAP组与N组相比，肺W/D值明显升高，且在各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)；莱菔硫烷组的肺W/D在各个时间点均低于SAP组(P<0.05)，见表2。

表1 不同时间处理组肺组织病理评分分)

注：与N组比较,*P<0.05;与SAP 组比较,#P<0.05。

表2 不同时间处理组肺W/D值比较

注：与N组比较,*P<0.05；与SAP 组比较，#P<0.05。

2.3 各组大鼠炎症因子的表达水平比较 SAP组大鼠肺组织中的TNF-α、IL-1β表达量明显高于N组(P<0.05)，在12 h内呈不断升高趋势。用莱菔硫烷干预处理后在各个时间点莱菔硫烷组的大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β的水平较SAP组明显下降(P<0.05)，见表3。

表3 不同处理组肺组织炎症因子水平比较

注：与N组比较,*P<0.05；与SAP 组比较，#P<0.05。

2.4 各组大鼠HO-1和COX-2 mRNA表达变化 造模后SAP组大鼠肺组织中的HO-1 mRNA表达量较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，予以莱菔硫烷干预后，莱菔硫烷组的HO-1 mRNA表达量较SAP组明显升高(P<0.05)。SAP组的COX-2 mRNA表达水平较N组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，莱菔硫烷组COX-2 mRNA表达量较SAP组明显下降(P<0.05)，见表4。

表4 不同处理组大鼠HO-1 和COX-2 mRNA表达量变化

注：与N组比较,*P<0.05；与SAP 组比较，#P<0.05。

2.5 SAP肺组织中HO-1 mRNA和COX mRNA、TNF-α、IL-1β的相关性分析 通过多元相关性分析发现随着COX-2 mRNA表达量的增高，TNF-α、IL-1β的水平也明显增高，呈正相关性(r分别为0.436、0.375，P<0.05)；HO-1 mRNA表达量与COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β的表达水平呈明显负相关，差异有统计学意义(r分别为-0.758、-0.425、-0.389，P<0.05)。

3 讨 论

急性胰腺炎相关性肺损伤(APALI)发病机制复杂，大量研究证实了炎性介质和炎症细胞的激活在介导APALI过程中发挥了关键的作用，尤其是TNF-α和IL-1β[5]。相关研究提示COX-2在炎性反应的过程中发挥了重要作用[6]，一方面TNF-α、IL-1β等炎症因子可以上调COX-2的表达，另一方面COX-2可进一步加重炎性反应和过氧化反应的发生，在损伤的炎性反应过程中形成了一个恶性循环。目前大量研究表明COX-2参与了多种急性肺损伤的发病机制过程，抑制COX-2的表达对缺血再灌注肺损伤、机械通气肺损伤、脓毒症肺损伤等均具有一定的保护作用[7-9]。Ethridge等[10]研究证实了破坏COX-2相关基因的表达可以减轻急性胰腺炎及APALI。HO-1作为内源性的保护蛋白近年来成为研究的热点和难点，而莱菔硫烷相关报道指出其与HO-1、COX-2具有一定的相关性，但其在APALI 中的具体作用机制尚未完全阐明，本研究主要探讨了莱菔硫烷对APALI的HO-1与COX-2炎性反应的相关性。

本文研究结果显示，造模后SAP组大鼠肺组织的湿干比、肺病理损伤评分及炎症因子的表达水平均较对照组明显升高，表明了APALI过程伴随肺水肿、肺损伤程度的加重，且SAP诱导了TNF-α、IL-1β表达水平的明显升高。值得注意的是SAP组的HO-1 mRNA表达量较正常对照也明显增高，为了进一步证实莱菔硫烷在APALI中的作用，本研究予以莱菔硫烷干预，结果肺组织中HO-1 mRNA的表达量较SAP组明显升高，同时伴随COX-2 mRNA、TNF-α、IL-1β表达量的下降，呈负相关，肺水肿、肺组织病理莱菔硫烷干预组也较SAP组明显好转。因此，本研究证实了莱菔硫烷诱导的HO-1表达的升高对APALI起到一定的保护作用。应用莱菔硫烷上调HO-1的表达有可能成为治疗APALI的新思路和方法。莱菔硫烷是一种可以食用的异硫氰酸盐，主要存在于花菜、西兰花以及甘蓝等十字花科植物中，日常食用西兰花(200 mg/d)可以有效地减少自发性高血压大鼠的高血压水平，炎性反应及氧化应激损伤。相关报道指出莱菔硫烷可以诱导多种组织细胞HO-1的表达，而HO-1除了分解血红素外，其代谢产物CO和胆绿素等在体内具有重要的生物学效应，包括抗氧化、抑制炎性反应等，激活HO-1相关的信号通路，促进HO-1的表达对多种肺损伤具有保护作用[11-12]。目前HO-1和COX-2之间的具体作用机制尚未完全明确，有研究表明HO-1有可能是通过MAPKs和Nrf2XIANG相关的信号通路来抑制COX-2的表达[13]，HO-1也可通过促进抗炎因子的表达来减轻炎性反应，例如IL-10，这样莱菔硫烷可能通过调控HO-1与COX-2通路起到减轻肺组织损伤的作用。

综上所述，本研究结果证实了莱菔硫烷可上调HO-1的表达量，而HO-1可能通过抑制COX-2、TNF-α、IL-1β表达而对APALI起到一定的保护作用，为临床治疗APALI提供了新的靶点和治疗思路，值得进一步深入研究。

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Effects of sulforaphane on expression of HO-1 and COX in lung tissue of severe acute pancreatitis rat

KongWen-ji

(DepartmentofPharmacy,ThirdAffiliatedHospitalofQiqihaerMedicalCollege,Qiqihaer,Heilongjiang161002,China)

Objective To study the effects of sulforaphane on the levels of HO-1 and COX-2 in the lung tissue of severe acute pancreatitis(SAP) rat model.Methods Seventy-two rats were randomly divided into three groups:control group(N group),SAP model group(SAP group) and sulforaphane group,24 cases in each group.The lung injury evaluation,wet-to-dry(W/D) ratio,levels of TNF and IL-1β protein and expression of HO-1 and COX-2 mRNA were measured at 3,6,12 h after operation.Results Compared with the N group,the levels of every indexes in the SAP group were higher (P<0.05).In the comparison with the SAP group,the pathological scores,W/D ratio,levels of TNF and IL-1β protein and expression of COX-2 mRNA were lower in the sulforaphane group,while expression of HO-1 mRNA was higher(P<0.05).The expression amounts of HO-1 mRNA showed the significantly negative correlation with the expression levels of TNF and IL-1β protein and expression of COX-2 mRNA(P<0.05).Conclusion Sulforaphane can reduce the lung injury by increasing the expression amount of HO-1 in lung,which may be related with inhibiting the expression of COX.

severe acute pancreatitis； sulforaphane； HO-1； COX

孔文基,女,本科,主管药师,主要从事药学研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.034

A

1672-9455(2015)14-2056-03

2015-01-25

2015-03-15)