钙黏附蛋白E和类赖氨酰氧化酶2在胆管癌中的表达及其相关性研究

王建华

(湖南省常德市第四人民医院消化内科 415000)



·论 著·

钙黏附蛋白E和类赖氨酰氧化酶2在胆管癌中的表达及其相关性研究

王建华

(湖南省常德市第四人民医院消化内科 415000)

目的 探讨类赖氨酰氧化酶2(LOXL2)和钙黏附蛋白E(E-cadherin)在胆管癌中的表达，并分析两者表达水平的相互关系。方法 应用免疫组织化学(SP)法和聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测胆管癌组织中E-cadherin和LOXL2 的表达情况。结果 E-cadherin 在胆管癌组的表达明显低于癌旁组织组和正常胆管组，差异有统计学意义(P<0.05)；LOXL2 在胆管癌组的表达明显高于癌旁组织组和正常胆管组，差异有统计学意义(P<0.05)。E-cadherin和LOXL2 在胆管癌中的表达呈负相关。结论 E-cadherin 的表达减弱和LOXL2 的表达增高共同参与胆管癌的发生和发展。

钙黏附蛋白E； 类赖氨酰氧化酶2； 胆管癌； 浸润和转移； 免疫组织化学方法； 聚合酶链式反应

胆管癌是发生于肝内或肝外胆管上皮的恶性肿瘤，恶性程度高。影响胆管癌患者治疗和远期生存率的主要因素是肿瘤的浸润和转移。本研究应用免疫组织化学(SP)法和聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测胆管癌中钙黏附蛋白E(E-cadherin)和类赖氨酰氧化酶2(LOXL2)基因的表达水平，并分析两者的相关性，对探讨胆管癌浸润、转移的分子机制具有重要的意义。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 该院2011年1月至2013年12月外科手术治疗的47例胆管癌患者的癌组织标本(胆管癌组)；47例胆管癌癌旁组织标本(距癌组织≥1 cm)(癌旁组织组)。所有患者术前均未接受过放疗和化疗，标本均经病理检查证实。取同期就诊于该院的良性胆管疾病患者的正常胆管标本20例(正常胆管组)。

1.2 检测方法 应用SP法和RT-PCR技术检测E-cadherin和LOXL2在所有标本组织中的表达水平。

1.3 仪器与试剂 YAQUANG生物组织脱水机，TB-718生理组织包埋机，AS325转轮式切片机，电子恒温水浴箱，光学显微镜，旋涡振荡器，干式恒温器K10CD，匀浆机，低温冷冻离心机，Real-Time检测仪ABI-7500。SP免疫组织化学染色试剂盒，DAB显色试剂盒，LOXL2鼠抗人单克隆抗体，SYBRGreen PCR试剂盒，逆转录cDNA合成试剂盒。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件对数据资料进行分析。计数资料采用χ2检验，计量资料使用wilcoxon秩和检验，相关分析应用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SP法检测3组患者E-cadherin和LOXL2的结果比较 见图1和表1。

2.2 RT-PCR检测3组患者E-cadherin和LOXL2 结果比较 见图2和表2。

表1 3组患者E-cadherin和LOXL2表达水平结果比较[n(%)]

注：A、B、C分别为胆管癌、癌旁组织、正常胆管中E-cadherin蛋白的表达；D、E、F分别为胆管癌、癌旁组织、正常胆管中LOXL2蛋白的表达。

图1 3组患者E-cadherin和LOXL2蛋白的表达

2.3 胆管癌组织中E-cadherin 和LOXL2 表达的相关性 胆管癌组织中E-cadherin 和LOXL2 表达呈负相关。见表3。

表3 胆管癌中E-cadherin和LOXL2蛋白表达的相互关系(n)

注：A、C、E分别为胆管癌组中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA荧光定量扩增曲线；B、D、F分别为胆管癌组织中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA荧光定量融解曲线。

图2 3组患者E-cadherin和LOXL2 mRNA的表达

3 讨 论

肿瘤的浸润和转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程，其中肿瘤细胞黏附、运动能力的改变，与细胞外基质间的相互作用是肿瘤发生浸润、转移的基础，也是其关键环节[1]。

3.1 E-cadherin在胆管癌中的表达及其与临床参数的关系 Chen等[2]用实验证实了E-cadherin可以限制L细胞侵袭。Peina-Slaus等[3]应用SP法检测了60例人脑膜瘤中E-cadherin的表达，发现70%的脑膜瘤样本中E-cadherin表达下调，提示E-cadherin的不稳定性在脑膜瘤的发生、发展中起着重要作用。Zhang 等[4]应用Western印迹和RT-PCR技术检测了胆管癌细胞株QBC939和FRH 0201，结果表明snail的激活和E-cadherin的抑制可能依赖人核转录因子(NF-κB)的激活，NF-κB促进snail上调，从而抑制E-cadherin表达，最终促进胆管癌的浸润、转移。本研究采用RT-PCR技术检测结果显示，E-cadherin 的表达在胆管癌组、癌旁组织组、正常胆管组中差异有统计学意义(P<0.05)。本组结果表明，胆管癌患者E-cadherin 表达减弱，与相关报道一致。E-cadherin的表达减弱与胆管癌的浸润、转移密切相关，其机制可能是E-cadherin减少或缺失，导致细胞间的黏附减弱，原有的细胞外基质降解、形成新的细胞-基质黏附，细胞运动能力增强，从而促进肿瘤的浸润、转移。

3.2 LOXL2在胆管癌中的表达及其与临床参数的关系 Peinado等[5]研究报道LOXL2的高表达与肿瘤的浸润、转移呈正相关，甚至在MDCK上皮细胞系中LOXL2过度表达可诱导完整的上皮间质转变(EMT)过程，伴随着上皮标志物的丢失和间质标志物的表达增加。Li等[6]研究发现，CC细胞株QBC939中HCVc可诱导EMT，其可能的机制是通过LOXL2的途径。Peng等[7]对胃癌组织表达相关分析显示，LOXL2通过Src/FAK通路而不是snail/E-cadherin通路促进侵袭。本研究应用RT-PCR技术检测LOXL2 的表达在胆管癌组、癌旁组织组、正常胆管组中差异有统计学意义(P<0.05)，提示胆管癌患者LOXL2 的表达增强，与其他研究一致。LOXL2的表达增强与胆管癌的浸润、转移相关，其机制可能是LOXL2的表达增强，通过缺氧调节作用，参与上皮间质转化，促进ECM重构等作用导致肿瘤的浸润、转移。

3.3 E-cadherin和LOXL2在胆管癌浸润转移中的相互关系 本研究在胆管癌组织中对E-cadherin和LOXL2的表达进行相关性实验，发现两者呈负相关关系(r=-0.464，P=0.001)。Peinado等[5]研究表明，赖氨酰氧化酶基因家族的2个成员LOXL2和LOXL3与snail相互影响，相互协同下调E-cadherin的表达。Schietke等[8]的研究也表明，LOXL2是HIF-1的一个直接靶基因，赖氨酰氧化酶的激活能抑制E-cadherin蛋白的表达，并且可导致缺氧从而抑制E-cadherin蛋白的表达，最终影响细胞的转化且促进细胞的浸润。本组实验结果与Peinado等的研究结果一致，E-cadherin的表达减弱和LOXL2的表达增高共同参与了胆管癌浸润、转移的发生和发展。E-cadherin和LOXL2的相关性机制可能是LOXL2导致缺氧从而抑制E-cadherin蛋白的表达；另外，LOXL2表达增高参与snail介导的E-cadherin沉默，导致E-cadherin表达减弱或缺失，致使细胞间的黏附减弱，原有的细胞外基质降解、形成新的细胞-基质黏附，细胞运动能力增强，同时LOXL2增高可直接诱导EMT形成，从而提高胆管癌细胞向他处浸润转移的能力，最终促进胆管癌的浸润、转移。

综上所述，本研究结果表明胆管癌组织中E-cadherin的表达减弱，LOXL2的表达增强，两者在胆管癌浸润、转移中的表达呈负相关，E-cadherin表达减弱和LOXL2表达增强与胆管癌的分化程度低、肿瘤分期高、淋巴结转移和组织器官转移密切相关，主要机制可能是两者相互作用导致胆管癌细胞间的黏附功能减弱或丧失，EMT形成，从而促进胆管癌细胞的浸润、转移。研究胆管癌中两者的表达及其相互关系对进一步了解胆管癌浸润转移的机制及评估预后具有重要的临床意义。

[1]Zheng XH,Wang SG.Advance in the study of invasion and metastasis of cholangiocarcinoma[J].Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2007,15(3):276-281.

[2]Chen WC，Obrink C.Cell-cell contacts mediated by E-cadherin restrict invasive behavior of L-cells[J].J Cell Biol,1991,114 (2):319-322.

[3]Peina-Slaus N,Nikuseva Marti T,Deak AJ,et al.Genetic and protein changes of E-cadherin in meningiomas[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,136(5):695-702.

[4]Zhang K,Zhaos J,Liu X,et al.Activation of NF-κB up-regulates snail and consequent repression of E-cadherin in cholangiocarcinoma cell invasion[J].Hepatogastroenterology,2011,58(105):1-7.

[5]Peinado H,Cruz M,Olmeda D,et al.A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression[J].EMBO J,2010,24(11):3446-3458.

[6]Li T,Li D,Cheng L,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by hepatitis C virus core protein in cholangiocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2010,17(6):1937-1944.

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The effect and relationship of E-cadherin and lysyl oxidase-like 2 in the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma

WANGJian-hua

(DepartmentofGastroenterology,TheFourthPeopl'sHospitalofChangdeCity,Hunan,415000,China)

Objective To explore the expression of E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma,and analyzed their relationship between the two factors in cholangiocarcinoma.Methods SP and RT-PCR were used to detect E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma.Results The expression of E-cadherin was significantly lower in cholangiocar-cinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of LOXL2 was significantly higher in cholangiocarcinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of E-cadherin was negatively related to that of LOXL2.Conclusion Both the down-regulation of E-cadherin and the up-regulation of LOXL2 were related to the occurrence and development of cholangiocarcinoma.

E-cadherin； LOXL2； cholangiocarcinoma； invasion and metastasis； SP； RT-PCR

王建华，女，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.033

A

1672-9455(2015)12-1742-03

2014-12-15

2015-02-05)