神经干细胞治疗臂丛神经根损伤的研究进展

张宇策(综述),张　军(审校)

(哈尔滨医科大学附属第四医院骨外科，哈尔滨 150001)

分子生物医学

神经干细胞治疗臂丛神经根损伤的研究进展

张宇策△(综述),张军※(审校)

(哈尔滨医科大学附属第四医院骨外科，哈尔滨 150001)

摘要：臂丛撕脱伤因其损伤位置特殊，单纯的手术治疗无法完全恢复，致残率很高，肌功能恢复欠佳，无法达到患者预期要求。已有研究报道，神经干细胞(NSCs)在治疗神经系统疾病(如胶质瘤等)方面被广泛应用，相关的实验中已证实其对相应的疾病恢复有明显的促进作用，因此NSCs为臂丛神经损伤的治疗提供了新的方向。虽然NSCs移植有利于臂丛神经损伤的治疗，但这是一个复杂的修复过程，有十分广阔的研究空间。

关键词:神经干细胞；臂丛神经；根性损伤；臂丛撕脱伤

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是干细胞中的一种特殊分类，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能进行自我更新。自1992年NSCs被首次从小鼠纹状体中提取并稳定传代及分化后，NSCs逐渐被广泛研究并应用到神经系统疾病中[1]。臂丛神经根损伤属于外周神经系统损伤，但由于其损伤部位介于中枢和外周神经系统的交界处，决定了其治疗上的特殊性。目前针对臂丛神经根损伤，虽通过手术可恢复部分功能，却无法挽回所有损失的功能，也很难减轻损伤后神经性疼痛[2-3]。术后大部分患者更希望能通过创新性的治疗(如干细胞治疗、神经再植术等)来进一步恢复功能以达到日常工作的状态[4]。因此，通过NSCs治疗臂丛神经根损伤有十分重要的意义，现对NSCs应用于臂丛神经根损伤的可行性及作用等进行阐述。

1臂丛神经根的损伤机制及治疗策略

臂丛神经根损伤大多发生在高速行驶的摩托车事故中。这是由于摩托车驾驶员在倒地的瞬间肩膀落地导致臂丛的牵拉力加大，瞬间的暴力将臂丛神经根拉伤。此外，常见的导致臂丛损伤的原因还包括高处坠落伤、锐器伤和医源性损伤等。临床所诊断的臂丛神经根损伤患者，70%是1～2个臂丛神经根的损伤[5]。

1.1臂丛神经根损伤机制外伤导致的臂丛神经根损伤是指臂丛神经根的牵拉、受损或者从脊髓直接撕脱。神经根的断裂可以发生在脊髓背根神经节到臂丛末端的任何部位，根据损伤的部位大体可分为两种类型：一种是撕脱损伤发生于脊髓交界区近端神经根或者根丝连续性的损伤，这种类型的损伤更接近于中枢神经系统损伤；另一种是发生于背根神经节的外周硬膜损伤,但是神经根的残余部分仍与脊髓相连。研究表明[6]，实验制造的臂丛撕脱伤动物模型中，高达80%的脊椎运动神经元会在损伤2周内萎缩和死亡。撕脱伤患者会伴随麻木、臂部感觉缺失以及非常强烈而顽固的神经痛。临床上经常会见到霍纳综合征、锁骨上方Tinel征缺失,如伴有高位神经根损伤(横膈膜神经，C3、C4、C5)可伴有同侧偏侧膈麻木，同时由于硬脊膜囊断裂导致的节前损伤会引起假性脑水肿。

1.2有关臂丛损伤及其治疗的相关研究由于椎管内的前后根仅以直径为1.3～1.9 mm的根丝与脊髓相连，很容易在外界暴力的牵拉下将脊髓根丝从脊髓中拔出，造成臂丛的根性撕脱伤[7]。通过对成年大鼠和乳鼠的臂丛撕脱伤模型的观察中发现，臂丛撕脱伤后可以引起内源性NSCs的增殖，但未见有神经元的分化，最终皆分化为星形胶质细胞；在神经营养因子方面，为保护臂丛神经根性撕脱伤后的神经元及促进再生,臂丛根性撕脱伤后早期成年大鼠脊髓内的神经营养因子高水平表达[8]。宋法寰等[9]在做大鼠臂丛撕脱伤术后应用Western blot方法测定相应脊髓节段C7、C8磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在1、2、3 d及正常大鼠的表达水平，同时应用免疫荧光染色法检测目标蛋白在1 d的大鼠脊髓节段的表达水平及空间定位，结果发现臂丛根性撕脱伤诱导磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在损伤节段1 d时高表达，然而在3 d时逐步下降到正常大鼠的表达水平。严重的神经损伤是臂丛连续性的中断，而这种损伤需要手术才能进一步恢复功能，因为其自发性的恢复几乎不会存在[10]。完全的臂丛撕脱伤是从C5到T1神经根的损伤，并且预后恢复最差。根据臂丛撕脱伤损伤的性质和程度不同，手术方法也不尽相同。目前臂丛撕脱伤外科治疗的主流方法是神经嫁接和移植游离有功能肌肉，而且这两种方法最有效的时间分别是创伤后 3～6个月和9～12个月。

2有关NSCs的研究

近年来，干细胞已经成为治疗多种疾病的研究热点。NSCs具有干细胞所具有的一般特点和性质，即呈未分化状态，且不表达特异性的分化标记，具有多向分化潜能和增殖能力，可以分化为本细胞系功能不同的大部分类型细胞，而且具有多分化潜能和自我更新能力,甚至终身，同时对疾病和损伤具有反应能力，可以产生新的细胞来完成相应组织的修复。与其他干细胞相比，NSCs来源于神经系统或能产生神经组织的细胞，可产生特定种类的细胞，即可以分化为神经元、胶质细胞及其前体细胞。

2.1分离和培养方法的进展NSCs的分离主要包括流式分选法、免疫磁珠法及原代培养法，其中以原代培养法最为常用：单个NSCs可形成克隆球，经免疫组织化学鉴定其阳性表达，表明分离出的为NSCs[11]。而原代培养又可以大体分为悬浮培养法-神经球法[1]以及贴壁细胞培养法[12]和Louis等[13]创建的神经集落形成实验。由于神经球法的方法简单，只需严格按照标准的程序操作就可达到很好的重现性，因此被广泛应用于研究胚胎、分离扩增和成体NSCs中；与悬浮培养法相比，贴壁培养法更有利于细胞的形态学观察和获取同质化的大数量细胞，对体内移植、基因的操作、发育学研究和进行严格的克隆分析具有重要意义，但也存在一定局限性，如当使用某些贴片剂时会有诱导NSCs分化的可能性，使某些实验的研究结果受到干扰；神经集落形成细胞实验可以用来区别NSCs和神经前体细胞，据此就能更加严格地评价NSCs的长期增殖和自我更新的能力，对于计数NSCs的频率是更有意义的一种方法。

2.2NSCs迁移的研究在神经系统的发生和发育的过程中NSCs能沿着发育索的方向进行迁移。有实验证明，移植后的NSCs同样保留了迁移能力[14]。NSCs的迁移包括生理性迁移和病理性迁移，NSCs的定向迁移不仅对机体的生长和发育具有非常重要的作用,对于中枢神经系统的损伤修复同样具有重大的意义[15]。调节NSCs迁移方面大体可分为迁移因子的调控和NSCs迁移的支架。迁移因子包括化学趋化因子/排斥因子(如slit蛋白、炎性趋化因子、脑源性营养因子、胶质源性营养因子及其他趋化因子)、细胞外基质、络氨酸激酶受体、聚唾液酸神经细胞黏附分子、Doublecortin、分离信号分子[16]。NSCs迁移的支架目前已发现3种：一种是Ramaswamy等[17]发现的NSCs沿着胼胝体的纤维束迁移到对侧皮质的损伤部位，并且研究发现移植到正常脑组织中的NSCs也以这种方式进行迁移；第2种迁移方式是NSCs沿着细胞的放射状突起迁移，vimentin阳性的胶质细胞可能是NSCs迁移的导向细胞[18]；另一种迁移方式是NSCs沿着血管迁移，Shen等[19]发现NSCs在吻侧迁移流的迁移流和血管平行，而NSCs依附于血管进行黏附和游走是由整合素介导的[20]，同时血管内皮细胞还会分泌一些因子对NSCs的迁移进行调节，如脑源性生长因子和血管内皮生长因子等。在NSCs沿着血管到损伤部位迁移的过程中,血管所起的作用不仅是细胞迁移的导向支架,还为NSCs的存活和分化提供一定的营养,在非神经发生区中维持NSCs的生长发育[15]。

2.3NSCs的弱免疫原性NSCs的免疫原性是影响移植免疫排斥反应的一个重要因素。细胞的免疫原性主要是由其表达的主要组织相容性抗原复合物所决定的。体外培养的NSCs免疫原性蛋白分子无表达或表达水平低，不足以引起免疫反应，同时NSCs的免疫原性受多种因素影响，如温度、NSCs发展阶段[21]等。高峰等[22]也通过实验进一步证实了小鼠NSCs具有较弱的免疫原性，且其免疫原性明显低于同一个体的肝细胞。因为NSCs的未分化特性，其细胞表面基本不具有免疫抗原，很少情况下被抗体识别，即有低免疫原性。因此，机体在移植异源的NSCs后，很少发生排异反应，该优点使NSCs移植在神经修复等医学领域有较好的发展前景。

2.4NSCs移植实验NSCs已被应用于治疗多种疾病的研究中。尹昌林[23]发现将NSCs植入荷瘤鼠肿瘤局部，随着肿瘤的生长而NSCs也不断增长，并跟随肿瘤细胞向其他部位迁移,如果将NSCs植入脑内远隔肿瘤部位，它也可穿越正常脑组织进入肿瘤组织内，甚至向荷瘤鼠尾静脉注射NSCs，在脑内也能发现注射的NSCs存在，最终达到治疗肿瘤的目的。

又如在脊髓损伤模型中，移植的NSCs可以存活、迁移、分化，并且在NSCs组，脑源性神经营养因子的mRNA明显上调，并促进生长相关蛋白43 mRNA的表达，从而改变脊髓损伤区域的微环境，NSCs在体外还能持续分泌几种特殊的神经营养因子，起到促进轴突生长的作用。在NSCs移植治疗神经退行性疾病中，曾水林等[24]在阿尔兹海默病模型中移植胚鼠端脑组织来源的NSCs后，发现其能显著改善脑组织胶质细胞化,并降低神经元损失比例。NSCs同样也可以应用于帕金森病的治疗，在NSCs联合胶质细胞源性的神经营养因子植入到帕金森病大鼠的纹状体内，发现其能明显提高帕金森病大鼠纹状体中多巴胺的含量，对帕金森病大鼠有一定的治疗效果。在治疗脑创伤中，Makri等[25]通过用微量注射器反复戳伤小鼠的大脑皮质来模拟机械性脑损伤，并在原位移植入BM88/Cend1(BM88/Cend1是神经元谱系中的特异性调节因子,可以调控细胞周期退出和神经元祖细胞分化)过表达的NSCs，结果显示，与对照组相比NSCs分化成神经元的比例提高了2.3倍，同时分化成为胶质细胞的比例降低40%，并减少了瘢痕组织的形成。

3NSCs种植于臂丛撕脱伤的实验进展

目前，实验证实臂丛根性撕脱伤脊髓前角NSCs移植后可为NSCs分化成星型胶质细胞和神经元提供适宜的微环境，脊髓源性NSCs移植可以明显降低前角运动神经元的继发性死亡，可对脊髓前角受损运动神经元起到保护作用，NSCs移植不仅能分化为神经元并且发挥神经元替代作用，还对神经根撕脱引起脊髓运动神经元死亡具有一定的保护作用,可以明显减少神经根性撕脱后的运动神经元继发性变性死亡[26]。有学者对比了不同的干细胞种植对臂丛撕脱伤的影响，如张军等[10]对比了骨髓干细胞和 NSCs种植于臂丛撕脱伤的大鼠模型中，证实了 NSCs更适合治疗臂丛撕脱伤。有学者主张应用胚胎干细胞，因为其具有发育的全能性，但是胚胎干细胞在移植后易形成畸胎瘤，这可能与该细胞和肿瘤细胞有着某些共同通路调节有关(如磷脂酰肌醇3-激酶通路)[27]，同时由于伦理的约束让其应用成为主要难题。与其他成体干细胞相比，NSCs有自己特有的优点。

Trolle等[28]用含绿色荧光蛋白的脊髓NSCs种植于臂丛神经根撕脱伤的模型中发现，位于脊髓外侧的移植细胞会形成表达神经胶质纤维酸性蛋白的细胞的延长的导管，这与形成感觉轴突或者脊髓表面的小细胞团有密切的联系，其余的细胞以单个细胞形式迁移至脊髓，分化为不同神经递质及纤维的脊髓神经元，最终得出NSCs可以在撕脱背根处很好的生存，并且在撕脱伤的外周可以明显观察到生长出的神经管的结论。Su等[29]对比NSCs种植于神经根撕脱伤模型和肌皮神经损伤的模型中，发现在肌皮神经损伤的模型中NSCs更容易分化成运动神经元，NSCs在适宜的环境下可以分化成具有运动功能的神经元，说明在应用NSCs治疗运动神经系统疾病的同时应注意改变种植环境。Su等[30]对比臂丛撕脱伤模型后不同时间段种植NSCs发现，损伤后2周种植NSCs的生长分化及功能的恢复要优于撕脱伤后立即及6周后种植NSCs。将神经营养因子3基因导入到NSCs，对比未转染该基因的NSCs种植于大鼠臂丛撕脱伤模型后的预后情况，得出神经营养因子3基因的局部表达确实对神经功能的恢复起到一定作用的结论。李晓涛等[31]将NSCs与雪旺细胞定期回植到颈神经根撕脱后的大鼠模型中，发现神经根回植术联合细胞移植可以加强神经元的保护作用，在大鼠体内，移植的SCs可以存活并且持续为NSCs提供支持、保护及营养等作用，还能促进NSCs向神经元样细胞方向分化。Su等[30]研究了锂盐对脊髓源性NSCs在体内和体外分化情况，发现锂盐可明显促进NSCs的分化和延伸生长，并且促进NSCs表达和产生脑源性神经生长因子，然而将NSCs移植到臂丛撕脱伤模型中，经锂盐治疗后，发现NSCs并没有表现出促进突触延长生长的表现，这一发现说明脑源性神经营养因子通路可能与锂盐诱导NSCs分化有关而并非是促进其突触延伸，同时也证明了锂盐可以促进臂丛撕脱伤的NSCs向神经元的分化并且产生脑源性神经营养因子。

4结语

NSCs治疗臂丛撕脱伤是一个复杂的过程，其中涉及NSCs的存活、分化、轴突生长方向、适宜的环境诱导及周围组织提供营养等，每个环节均能影响预期的实验效果，而其中的关系和问题目前还处于研究探索阶段。但随着技术发展以及对臂丛撕脱伤更深入的研究和认识，更多的实验技术和方法可以为改进NSCs的治疗提供帮助，如生物导管、可降解或者非可降解材料制造的神经导管、基因转染技术使NSCs特异性表达某一特有功能后回植等的应用。由此可见，应用NSCs治疗臂丛撕脱伤有广泛的研究空间，同时NSCs的应用将为患者带来更好的预后，大大改善其生活质量。

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Research Progress of Treatment for Brachial Plexus Injury with Neural Stem CellsZHANGYu-ce,ZHANGJun.(DepartmentofOrthopedicSurgery,theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Brachial plexus avulsion is a special injury for its location,surgical treatment alone will not be able to realize full recovery,since the injury results in high disability rate and poor muscle function recovery,failing to meet the postoperative expectations.As it is reported that neural stem cells(NSCs) have been widely used in the treatment of nervous system diseases(such as glioma),which is a significant promoting factor for recovery of threlated disease.NSCs provide a new direction for the treatment of brachial plexus injury.NSCs transplantation is beneficial to the treatment of brachial plexus injury,but it is a complex process which means a very broad space for the research.

Key words:Neural stem cells; Brachial plexus; Root injury; Brachial plexus avulsion

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-02-07编辑：伊姗

基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目(D200901)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.001

中图分类号:Q2-33

文献标识码:A

文章编号：1006-2084(2015)17-3073-04