苍术酮对体外培养肝癌细胞HepG2的抑制作用

郭楠楠

(深圳大学生命科学学院，广东深圳518000)

肝癌即肝脏恶性肿瘤，其中的原发性肝癌是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤，由于病毒性肝炎和环境等因素的影响，肝癌有逐年上升的趋势，且肝癌病人的相对生存率极低，所以对于治疗肝癌的新药物的需要就显得尤为迫切。

苍术酮是传统中药白术的有效成分之一，属于倍半萜类化合物，目前关于苍术酮的药理作用报道不多，已有的研究表明苍术酮具有降血糖、抗衰老、抗炎、保护肝损伤等作用，而目前国内外关于苍术酮对肝癌细胞增殖的抑制及其凋亡发生机制的研究不多，为此笔者通过检测苍术酮对肝癌细胞活性的影响、细胞形态的变化及对细胞周期和凋亡的影响来探讨其凋亡机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验仪器。CO2恒温培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜。

1．1．2 试验试剂。苍术酮由深圳大学化工学院提供;CCK－8、细胞周期与凋亡试剂盒均由碧云天生物研究所提供;HepG2购自上海生物研究所。

1．1．3 细胞培养。试验所用细胞需放置于含有5%CO2的37℃细胞培养箱中培养传代，用含10%胎牛血清及双抗(青霉素/链霉素)的DMEM高糖培养基进行培养;用0．25%胰酶－EDTA消化传代，放于5%CO2的37℃细胞培养箱中继续培养。

1．2 方法

1．2．1 CCK－8检测苍术酮对细胞增殖的抑制作用。取对数期生长细胞，胰酶消化吹散成单细胞状态，调整细胞到合适浓度接种于96孔板，每孔100μl，培养24 h后去培养液，每孔加10、25、50、85、100 μg/ml的苍术酮溶液处理，同时设立调零组和对照组，每组6个复孔。继续培养24、36、48 h后，每孔10μl的CCK－8溶液，继续孵育4 h后，在酶标仪上测各孔450 nm吸光度值，按以下公式计算细胞活力:细胞活力(%)=［(处理组 －空白组)/(对照组 －空白组)］×100%。

1．2．2 相差显微镜观察苍术酮诱导细胞形态的变化。取对数期生长的细胞，胰酶消化离心后吹散成单细胞状态，以适当细胞浓度接种于24孔板，每孔1 ml，培养24 h后，换25、75、100μg/ml药物组处理，设对照组，24 h后放置相差显微镜下进行观察。

1．2．3 苍术酮诱导HepG2细胞的细胞核的变化。取对数生长期细胞，调整到适当细胞浓度接种于六孔板，培养24 h后，换不同浓度含药培养基，同时设对照组继续培养24 h后，去除培养液，加入固定液0．5 ml，固定10 min。去除固定液，PBS洗涤细胞2遍，每次3 min，尽量吸尽PBS。加入0．5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min。去除染色液，PBS洗涤2遍，每次3 min，吸尽PBS，滴加一滴抗荧光淬灭封片液，即可在荧光显微镜下观察。

1．2．4 AnnexinV/PI双染法检测细胞的凋亡。取对数期生长细胞，消化后吹散成单细胞状态，以适当的细胞浓度接种于六孔板每孔2 ml。培养24 h后，换25和50μg/ml药物组处理，设对照组继续培养24 h后收集细胞待用。PBS重悬离心细胞2次，弃上清，加入195μl AnnexinV－FITC结合液重悬细胞，加入5μl AnnexinV－FITC轻轻混匀，加入5μl碘化丙啶染色液混匀，室温避光孵育20 min，即可上机通过流式细胞仪进行检测。

1．2．5 细胞周期的检测。取对数生长期细胞消化后吹散成单细胞状态，以适当的细胞浓度接种于六孔板每孔2 ml。培养24 h后换25和85μg/ml药物组处理，设对照组继续培养24 h后收集细胞待用。预冷PBS洗涤离心细胞2次，加入1ml预冷70%乙醇混匀，4℃固定4 h。离心沉淀细胞，PBS洗涤离心一次，每管加入0．5 ml碘化丙啶染色液，37℃水浴30 min，随即可用流式细胞仪上机检测。

1．2．6 数据分析。每项试验至少重复3次，结果是以平均值±标准差的方式表示，方差分析采用t－test，P＜0．05时有统计学意义。

2 结果与分析

2．1 苍术酮对Hep G2细胞生长的抑制作用 由图1可知，苍术酮对HepG2细胞的生长有抑制作用。不同浓度的苍术酮处理细胞24、36、48 h后，随着苍术酮浓度的升高，对HepG2细胞的增殖抑制作用也增加，表现为细胞活力的降低;在10～100μg/ml浓度范围内的细胞活力与该组对照相比均有显著差异(P＜0．01)。

2．2 相差显微镜观察苍术酮处理后Hep G2细胞形态的变化 通过相差显微镜观察可以看出苍术酮能抑制肝癌细胞的生长(图2)。没经药物处理的细胞呈不规则多边形贴壁生长，细胞紧密相接，细胞边缘轮廓清晰，生长状态饱满，有的甚至堆积生长;而经药物苍术酮处理的细胞变得扁平，脱壁，细胞间接触不紧密，细胞边缘轮廓不完整，碎片状物质增多，胞浆中类似颗粒物的物质增多。

2．3 荧光显微镜观察苍术酮作用后HepG2细胞的细胞核变化 由图3可见，未经苍术酮作用的细胞经Hochest33258染色后细胞核呈圆形或椭圆形，分布均匀，无深染的明亮点，荧光显微镜观察下呈现均匀的弱蓝色荧光;而经苍术酮处理的细胞，随着药物剂量的加大，细胞形态发生了明显的改变，有许多明亮点出现，这可能是凋亡早期细胞核染色质凝集所致，有些还具有细小的碎片，可能与细胞核裂解有关。

2．4 苍术酮对Hep G2细胞凋亡的影响 分别用苍术酮浓度为0、25、50μg/ml培养液处理细胞24 h后，细胞早期凋亡与晚期凋亡显示(图4)，在苍术酮浓度较低时，晚期凋亡的细胞比例较低，随着药物浓度的增加，晚期凋亡的细胞比例增加，但小于早期凋亡细胞的比例，暗示着苍术酮在较高浓度时可能更倾向于促进细胞早期凋亡。

2．5 苍术酮对Hep G2细胞周期的影响 细胞周期是指由 细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需时间分为4个阶段。其测定原理就是根据细胞不同时期(G1、S、G2、M)中DNA的含量不同进行的，通过检测不同时期与DNA结合的荧光染料的荧光强度来反映DNA含量。结果显示(图5)，与正常组相比，25和85μg/ml苍术酮处理细胞24 h后，随着苍术酮作用浓度的升高，G1期所占细胞的数量减少(图中左边数第1个峰)，G2期所占细胞的数量逐渐增多(图中左边数第2 个峰)，0、25、85 μg/ml浓度对应下的 G2期细胞百分比分别是12．8%、16．9%、28．2%。由此表明苍术酮抑制HepG2细胞增殖是通过将细胞阻滞在G2/M期。

3 结论与讨论

苍术酮是中药材白术的有效成分之一，而作为传统中药的白术素来有“南术北参”的美誉，其祛风散寒、健脾益气、明目的功效早在我国古典药典中就有记载。随着近年来对白术药理学的研究，人们发现白术还有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及免疫调节等作用，只是长期以来，白术只是作为其他中药的配方来服用，大大限制了它自身的利用。如果把白术中的成分提纯，将无疑大大提高它的利用价值。目前针对白术的有效成分之一苍术酮的研究报道就很少，董大京等研究表明苍术酮对高血压有独特的疗效［1］，Hwang等研究表明苍术酮对肝损伤的保护也起到一定的作用［2］。苍术酮属于倍半萜类化合物，具有的多种生物学活性也有待开发。细胞凋亡是细胞在受到外界环境因素及病理性信号刺激后发生的由基因控制的一系列细胞主动有序的死亡过程［3］。大量试验表明，目前对于一些类似传统中药黄芪、紫杉醇等［4－6］均可以通过诱导细胞凋亡而发挥各自独特的抗肿瘤作用，而有关苍术酮对肿瘤细胞抑制影响作用的报道不是很多。

该试验中，主要探讨了苍术酮对HepG2细胞的生长抑制作用，细胞的增值活性是反映细胞增值能力与生理功能的重要指标，当细胞因外界刺激受到损伤时，首先表现的就是其增值活性的降低。CCK－8法是目前测定细胞增值与细胞毒性的常用方法之一，CCK－8属于MTT的升级产品，且重复性好，其测定原理为WST－8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞的毒性成反比。颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。该试验结果表明，随着苍术酮剂量浓度的增大和作用细胞时间的延长，细胞增值受到抑制，细胞活力降低。采用不同浓度苍术酮作用HepG2细胞后，在相差显微镜下对细胞形态进行观察发现，对照组细胞贴壁生长，细胞紧密相接，生长旺盛，药物作用后细胞变得扁平，细胞间接触不紧密，胞浆中类似颗粒物的物质增多，且伴随有碎片物质的产生;Hoechst33258染色后在荧光显微镜下进行观察发现，对照组的细胞核染色后成均匀弱蓝色荧光，经药物处理的细胞由于部分染色质会出现浓缩状态，所以染色的细胞核会出现许多明亮点。此外，该试验用流式细胞仪对细胞周期的测定表明苍术酮能通过将细胞阻滞在G2/M期来抑制细胞的增殖。

总之，该试验研究表明苍术酮对HepG2细胞的生长有明显抑制作用，并诱导凋亡的发生，其作用强度随药物浓度成正相关，有明显的剂量依赖性，这对今后深入研究苍术酮对肝癌细胞的凋亡机制奠定一定的理论基础，也为进一步深入研究苍术酮作为治疗肝癌的新药和临床应用提供初步的试验依据。

［1］董大京，刘兰祥，张建．苍术酮对高血压的疗效［J］．河北医学，1997，3(4):63 －64．

［2］HWANG JM，TSENG TH，HSIEH Y S，et al．Inhibitory effect of atractylon on tert－butyl hydroperoxide induced DNA damage and hepatic toxicity in rat hepatocytes［J］．Arch Toxicol，1996，70:640 －644．

［3］VAN ENGELAND M，NIELAND L J，RAMAEKERS F C，et al．Annexin V－affinity assay:a review on an apoptosis detection syetem based on phosphatidylserine exposure［J］．Cytometry，1998，31:1 －9．

［4］KUMMALUET．Molecular mechanism of herbs in human lung cancer cells［J］．JMed Assoc Thai，2005，88:1725 －1734．

［5］刘伟，毕富勇．中药诱导肝癌细胞凋亡的实验研究进展［J］．安徽医学，2009(10):1250 －1253．

［6］郑炜望，华海清．中药诱导肝癌细胞凋亡的研究进展［J］．世界华人消化杂志，2009(28):2915 －2918．