芦荟苷对亚慢性AFB1致大鼠免疫损伤的干预作用

魏良鑫，崔 燕，钱 和

(江南大学食品学院/江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

黄曲霉毒素(Aflatoxins，AF)主要是由产毒寄生曲霉和黄曲霉代谢产生的一类结构相似的二呋喃香豆素化合物［1］。AFB1为主要存在形式且毒性最高，普遍存在于环境、土壤及粮食作物中，癌症研究机构(IARC)在1993年将其划定为I类致癌物［2］。AFB1在CYP450酶的作用下能够诱发生成大量活性氧(ROS)，攻击细胞膜，引起脂质过氧化，导致氧化应激损伤［3］;同时，AFB1在体内的代谢还会破坏 DNA、RNA、脂肪、蛋白质及能量代谢，从而降低机体抗氧化能力［4］。此外，AFB1具有较强的免疫抑制毒性，主要通过作用于机体的细胞免疫系统，诱发炎症反应［5］。越来越多的研究表明，饲料或食物中连续长期摄入低剂量AFB1会严重危害动物和人类的健康。

芦荟苷(Aloin)是芦荟渗出物中常用的活性成分之一，因其优异的通肠润便功能已经在减肥和治疗便秘药物中得到广泛应用。研究已经证实芦荟苷具有较强的抗氧化活性，能够显著抑制结肠损伤模型大鼠中MDA的生成，提高结肠中GSH、GSH-PX和CAT等抗氧化物的水平，进而改善氧化应激状态［6］。此外，人们还发现芦荟苷具有突出的抗炎功效，能够抑制大鼠结肠中TNF-α和IL-1βmRNA的表达，从而减轻硫酸葡聚糖钠引发的炎症反应［7］。以前的研究也发现芦荟苷可以显著抑制因长期酒精摄入而引起的小鼠肝脏炎症反应。

尽管很多数据证实了芦荟苷具有提高抗氧化能力、改善免疫功能和抑制炎症反应的作用，但是是否能够预防由AFB1诱导的大鼠氧化应激和免疫抑制还不确定。笔者通过大鼠长期低剂量AFB1的摄入试验，分析其体重变化、脏器指数、脾脏氧化状态、免疫功能和炎性细胞因子的表达量，研究芦荟苷对AFB1诱发大鼠免疫损伤的化学预防作用，从而为芦荟的开发与利用提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1 材料。Wistar雄性大鼠(5周龄)，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司;芦荟苷(纯度≥98%)，购自成都瑞芬思生物科技有限公司;AFB1和考马斯亮蓝G-250，购自Sigma公司;福临门玉米油，购自乐购超市;牛血清白蛋白(BSA)、NaCl、无水乙醚、无水乙醇，均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯产品;MDA、CAT、GSH、GSH-PX和SOD试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司;IgA、IgG、IgM、IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ ELISA试剂盒，均购自 R＆D 公司;无液氮RNA样品保存液、动物总RNA提取试剂盒，均购自上海捷瑞生物工程有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，购自 MBI Fermentas公司;Power SYBR®Green PCR Master Mix，均购自美国ABI公司。

1．1．2 仪器。PL2002电子分析天平，为Mettler Toledo仪器有限公司产品;HH-4数显恒温水浴锅，为上海申顺生物科技有限公司产品;M5酶标仪，为美国Molecular Devices公司产品;超低温冰箱，为美国 Thermo Scientific公司产品;IKA T10分散机，为德国IKA公司产品;Optima L-80XP超速离心机，为美国Beckman公司产品;One Drop微量紫外分光光度计，为上海采邑生物科技有限公司产品;PCR仪，为美国MJ公司产品;7900高通量快速实时荧光定量PCR仪，为美国ABI公司产品。

1．2 试验方法

1．2．1 实验动物的选择和饲养管理。选用5周龄健康的雄性Wistar大鼠40只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物房温度控制在(23±2)℃，湿度为(60±5)%，12 h昼夜交替，整个饲养期间保证供应充足的食物和水，每周更换垫料2次。试验中动物管理与饲养方法经江南大学实验动物管理与动物福利伦理委员会审查通过，所有操作严格按照江南大学实验动物中心有关规定执行。

1．2．2 动物分组及试验设计。基础饲料适应性喂养7 d后，禁食不禁水12 h，称重，并根据体重将大鼠随机分成5组，每组8只，具体分组为:空白对照组;芦荟苷高剂量空白对照组(苷空组，芦荟苷剂量为30 mg/kgBW);AFB1模型组(模型组，AFB1剂量为200μg/kgBW);芦荟苷低剂量干预组(低苷组，芦荟苷剂量为10 mg/kgBW);芦荟苷高剂量干预组(高苷组，芦荟苷剂量为30 mg/kgBW)。

1～2周，所有大鼠每天根据体重灌胃10．0 ml/kg剂量的溶剂水(空白组和模型组)或者相应剂量的芦荟苷;3～7周，模型组和干预组大鼠每天以溶于玉米油中的200 μg/kgBW剂量AFB1灌胃，空白组灌胃玉米油;1 h后，所有组大鼠按照1～2周的操作继续灌胃1次。

整个试验期间，每天观察大鼠的自主活动、反应性、饮水、饮食、粪便排泄和毛发光泽等，大鼠每天称重并记录每组动物的摄食量，观察并记录体重变化。第7周试验结束时，大鼠禁食12 h，称重，乙醚麻醉，迅速用普通真空采血管心脏取血。断颈处死，迅速打开腹腔，摘取脾脏和胸腺，生理盐水清洗后称重;取部分脾脏组织制备10%脾脏组织匀浆液，用于抗氧化能力的研究;取部分脾脏组织块用无液氮RNA样品保存液处理，用于后续RNA的研究。

1．2．3 脾脏组织抗氧化能力的测定。

1．2．3．1 10%脾脏组织匀浆液的制备。大鼠解剖后，立即准确称取部分脾脏组织，按重量∶体积的比例，加入9倍体积预冷的生理盐水，使用手持式电动匀浆机在冰上制作浓度10%的脾脏组织匀浆液。

1．2．3．2 Bradford法测定蛋白浓度。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰位置由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕黑色变为稳定的蓝色，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。测定波长595 nm处的吸光值，通过0．1 mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)标准液绘制的标准曲线，计算出蛋白质浓度。

1．2．3．3 抗氧化指标的测定。根据试剂盒说明书步骤，测定脾脏组织中MDA、CAT、GSH、GSH-PX和SOD含量，而脾脏组织中蛋白浓度采用Bradford法测定。

1．2．4 血清生化指标的测定。

1．2．4．1 血清的制备。心脏取血待凝结后，4℃下3 000 r/min离心10 min，分离上清液，将得到的血清进行冷冻保存，用于后续生化指标的测定。

1．2．4．2 血清中免疫球蛋白含量的测定。使用ELISA试剂盒检测血清中IgA、IgG和IgM含量。

1．2．4．3 血清中细胞因子含量的测定。采用ELISA方法检测血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。

1．2．5 大鼠脾脏组织中mRNA的测定。

1．2．5．1 总RNA的提取。取出经RNA保存液处理的脾脏组织约50 mg，梯度解冻，-20℃放置30 min后置于冰上。具体操作按照Generay动物总RNA提取试剂盒步骤进行总RNA的提取。用One Drop测定RNA纯度和浓度，根据所测定浓度，用灭菌的 DEPC-H2O稀释至200 ng/μl，用于后续RNA逆转录。所有塑料制品一次性使用，玻璃和金属制品严格按照要求处理后使用。

1．2．5．2 脾脏总RNA的逆转录。以稀释后200 ng/μl的RNA样品为模板，用Oligo(dT)18为引物进行反转录。RTPCR 反应体系为:模板 RNA(1 μg 75．0 μl、Oligo(dT)181．0 μl、DEPC-H2O 6．0 μl，共12．0 μl。65 ℃孵育5 min，迅速置于冰上冷却。然后，加入5×Reaction Buffer 4．0μl、RNA 酶抑制剂 1．0 μl、dNTP 2．0 μl、M-MuLV 逆转录酶1．0 μl，42 ℃孵育60 min，70℃5 min，终止反应。将所得产物于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1．2．5．3 实时荧光定量PCR。登陆NCBI网站，于GenBank数据库中查阅各基因序列号，根据基因序列，用Primer 6设计目的基因和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，具体序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR的引物序列

以“1．2．5．2”中RT-PCR 得到的 cDNA 为模板，稀释适当倍数，根据SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应体系(10．0μl):SYBR Premix EX TaqⅡ5．0 μl、PCR 引物Mix 0．8 μl、cDNA 模板1．0 μl、双蒸水3．2 μl。RT-PCR反应条件:预变性95℃ 10 min;95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环。检测各模板 Ct值，通过2-△△Ct法进行计算，以相对表达量进行比较和评估。

1．2．6 数据处理。试验数据以平均值±标准误(X±SE)表示。使用SPSS21．0软件以One-way ANOVA法及Duncan检验对试验数据进行组间比较和差异显著性检验。P＜0．05表示存在显著性差异。数据绘图采用Origin8．5软件。

2 结果与分析

2．1 芦荟多糖对AFB1中毒大鼠生长状况和体重的影响 试验期间，各组大鼠均无死亡现象。通过观察各组生长状况发现，空白组大鼠食欲良好，毛色正常、顺滑有光泽，精神状态正常;模型组大鼠食欲不振、体形消瘦，毛色暗淡无光，精神萎靡;芦荟苷干预组与模型组大鼠相比，症状明显好转，生长状况也有不同程度改善。

从图1(A)可以看出，连续5周低剂量AFB1的摄入导致试验结束时模型组大鼠体重显著低于空白对照组;然而，灌胃AFB1的同时给予芦荟苷干预有效减缓了AFB1引起体重增长缓慢的问题，与模型组大鼠相比低高剂量组大鼠体重都有显著性提高。同时，试验结束时，苷空组大鼠体重显著低于空白对照组，这可能与芦荟苷具有良好的通肠润便和减肥作用有关。芦荟苷低高剂量干预组大鼠之间的体重差异也验证了这种说法。

由脏器质量除以体重得到脏器指数，它是衡量机体健康状态的初步观察指标之一。从图1(B)可以看出，AFB1长期摄入对大鼠免疫器官脾脏和胸腺造成了损伤。与空白组相比，模型组大鼠脾脏指数和胸腺指数均显著性降低，表明AFB1对机体免疫系统产生较大损伤，造成体重降低，免疫器官受损。芦荟苷的干预可以有效缓解AFB1造成的免疫器官萎缩，低高苷组大鼠的脾脏指数和胸腺指数均显著高于模型组，并与空白对照组正常水平相当，由此可以推测这可能与芦荟苷具有良好的抗炎作用有关。

2．2 芦荟苷对AFB1中毒大鼠脾脏抗氧化能力的影响 通过测定大鼠脾脏中的MDA、CAT、GSH、GSH-PX和SOD来衡量其抗氧化能力。从表2可以看出，与空白组相比长期AFB1的摄入显著提高模型组大鼠脾脏中脂质过氧化产物MDA的含量;芦荟苷干预组可以使MDA水平显著降低，甚至显著低于空白组，而低苷组和高苷组之间没有显著差异。同时，模型组大鼠脾脏各抗氧化物指标(包括CAT、GSH、GSH-PX和SOD)均显著低于空白组，其活性分别降至空白组的 75．7%、77．6%、48．2%和 75．2% ，表明 AFB1的连续摄入显著降低了大鼠脾脏的抗氧化能力，诱发了严重的氧化应激损伤;而芦荟苷的干预可以使大鼠脾脏各抗氧化物水平显著提高，除GSH-PX以外均恢复至正常水平。

表2 芦荟苷对大鼠脾脏抗氧化状态的影响

2．3 芦荟苷对AFB1中毒大鼠血清免疫球蛋白含量的影响 从图2可以看出，与空白组相比，模型组免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量均无显著变化(P≥0．05)，说明5周200 μg/kgBW的AFB1摄入对大鼠的体液免疫应答无显著影响;同时，芦荟苷的干预也未对各免疫球蛋白的含量产生显著影响。

2．4 芦荟苷对AFB1中毒大鼠血清中炎性细胞因子的影响 从图3可以看出，与空白组相比，长期低剂量AFB1的摄入显著增加了大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的水平，同时通过苷空组和空白组的对比结果可以排除芦荟苷的摄入对这4种细胞因子可能造成的影响。在芦荟苷的干预下IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量均显著下降，其中对IL-1β和TNF-α的影响还呈现出一定的剂量差异性。

2．5 芦荟苷对AFB1中毒大鼠脾脏中炎症相关基因mRNA表达的影响 试验中通过RT-PCR对大鼠脾脏中炎性细胞因子基因mRNA的表达量进行了检测。从图4可以看出，长期低剂量AFB1的暴露使脾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达量显著提高，分别达到空白组的2．7倍、2．6倍、2．1倍和1．75倍。与模型组相比，芦荟苷的干预下IL-1β、IL-6和IFN-γ的基因表达量均有显著性下降，其中低高剂量组IL-1β的表达量分别下降7．4%和29．6%，IL-6表达量分别下降38．5%和42．3%，IFN-γ表达量分别下降20．0%和31．4%。低高剂量芦荟苷对TNF-α的mRNA表达量也有降低效果，但未达到显著水平。

3 结论与讨论

笔者研究发现芦荟苷对亚慢性低剂量AFB1致大鼠免疫损伤具有一定的预防作用，主要通过抑制AFB1暴露引起的体重增长缓慢和免疫器官萎缩，改善脾脏抗氧化能力，抑制炎性细胞因子表达来发挥作用。该研究结果可为芦荟的开发与利用提供依据。

研究表明，AFB1暴露会影响机体体重自我调节的能力，引起食欲不振，营养物质不能充分利用，进而导致体重下降［8］。Osborne 等［9］指出 AFB1可以改变消化道酶酶活，通过降低胰脂酶、淀粉酶和胰蛋白酶等活性，引起吸收障碍，从而导致体重增长缓慢。另外，AFB1的环氧产物AFBO可以结合DNA和蛋白质，改变酶反应工程，通过引起糖原异生以及柠檬酸循环、脂肪酸合成紊乱等，导致体重增长缓慢［10］。这与该试验AFB1导致大鼠体重增长缓慢的结果相一致，而芦荟苷对该试验结果具有明显改善作用的具体原因还需要进一步研究。

有学者认为AFB1中毒过程中氧化应激是引发与促进免疫器官损伤的一大机制。当人体或动物摄入AFB1后，可以诱导机体产生大量ROS，攻击细胞膜脂质，发生脂质过氧化，改变细胞膜的流动性和通透性，导致机体的氧化应激损伤［3］。MDA是多不饱和脂质过氧化的主要产物，可以通过测定MDA含量来间接了解细胞的受损程度和机体脂质过氧化的严重程度［11］。GSH、SOD、CAT和 GSH-PX 是机体内源性抗氧化防御系统的重要组成部分，在清除自由基和维持细胞内氧化还原平衡方面发挥着重要作用。研究表明，AFB1的摄入造成了机体抗氧化物水平的下降，从而引发机体的氧化应激损伤［12］。笔者在该试验中得到了相同的结果，AFB1主要通过提高脾脏中脂质过氧化产物MDA含量和降低内源性抗氧化物GSH、SOD、CAT及GSH-PX水平来造成机体氧化应激损伤，而芦荟苷通过有效的抗氧化能力来有效清除ROS，抑制脾脏脂质过氧化，提高抗氧化水平，减轻氧化应激损伤，从而起到保护脾脏的作用。

血清免疫球蛋白的测定是检查体液免疫功能最常用的方法［13］。IgA、IgG、IgM水平就可以反映血清免疫球蛋白的水平。AFB1对免疫系统具有较强的抑制作用，能够降低机体对寄生虫、真菌及细菌继发感染的抵抗能力。Panangala等［14］报道AFB1的暴露显著影响小鼠血清中IgA和IgG含量。研究表明，AFB1的摄入增加了猪血清中免疫球蛋白含量(IgG和IgM)［15］。然而，也有一些研究表明AFB1不影响机体的体液免疫［16］，这与试验结果相一致，AFB1对大鼠血清中IgA、IgG和IgM含量没有显著影响。究其原因，可能与AFB1暴露的剂量、时间，不同试验物种的敏感性以及其他试验条件(如动物的健康状况和管理状况)有关［17］。

研究表明，AFB1不仅可以诱导机体产生免疫抑制，也能够造成炎症反应，从而损伤机体。IL-1β在免疫调节及炎症进程中扮演着重要角色，主要通过刺激炎症和自身免疫病相关基因的表达，诱导环氧化酶2、一氧化氮合酶、干扰素γ和黏附分子等效应蛋白的表达［18］。IL-6是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子，现已发现在多种与炎症反应相关的疾病中IF-6异常过度升高，其可以作为预测炎症反应程度的重要标志物之一［19］。TNF-α由单核巨噬细胞产生，可通过负反馈调节激活单核巨噬细胞释放大量IL-1β、IL-6和IFN-γ等促炎因子，在整个炎症过程中起着核心作用［20］。IFN-γ主要是由CD4+Th1细胞和NK细胞分泌的促炎症细胞因子，参与了多种自身免疫性疾病的发生发展，可激活巨噬细胞诱导一氧化氮合酶(iNOS)的产生，促进NO的合成。现已确认IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 是机体内重要的促炎细胞因子［21］。在生理状态下人体液中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ水平较低，但在病理状态下其分泌量增加引起各种炎症因子的瀑布式释放，从而导致炎症反应，引起组织细胞损伤。脾脏是机体内最大的外周免疫器官，在炎症反应和获得性免疫应答方面发挥着重要作用。因此，通过测定脾脏中这4种细胞因子含量可以间接反映机体的免疫状态。笔者通过检测大鼠血清中炎性细胞因子含量和脾脏中相关细胞因子基因mRNA的表达量发现芦荟苷对长期低剂量AFB1连续摄入引起的炎症反应具有一定的改善作用，进一步证实了芦荟苷良好的抗炎作用，但其作用的机理还需要进一步研究。

［1］HOLMQUIST G U，WALKER H W，STAHR H M．Influence of Temperature，pH，Water Activity and Antifungal Agents on Growth of Aspergillus flavus and A．parasiticus［J］．Journal of Food Science，1983，48(3):778-782．

［2］IARC．Some Naturally Occurring Substances:Food Items and Constituents，Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins［C］//IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans．France:IARC，1993:243-395．

［3］CHOI K C，LEE B S，CHUNGW T，et al．Protective effects of apigenin and quercetin on aflatoxin B1-induced immunotoxicity in mice［J］．Food Science and Biotechnology，2010(4):987-992．

［4］BUSBY W F，WOGAN G N．Aflatoxins［C］//SEARLE E S．Chemical Carcinogens，ACSMonograph．Washington:American Chemical Society，1984:945-1136．

［5］SHAY K P，MOREAUR F，SMITH E J，et al．Alpha-lipoic acid as a dietary supplement:molecular mechanisms and therapeutic potential［J］．Biochim Biophys Acta，2009(10):1149-1160．

［6］HAMIZA OO，REHMANM U，KHANR，et al．Chemopreventive effects of aloin against 1，2-dimethylhydrazine-induced preneoplastic lesions in the colon of Wistar rats［J］．Human ＆ Experimental Toxicology，2014(2):148-163．

［7］PARK M Y，KWONH J，SUNGM K．Dietary aloin，aloesin，or aloe-gel exerts anti-inflammatory activity in a rat colitis model［J］．Life Sci，2011(11/12):486-492．

［8］RASTOGIR，SRIVASTAVA A K，RASTOGI A K．Biochemical changes induced in liver and serum of aflatoxin B-1-treated male Wistar rats:Preventive effect of picroliv［J］．Pharmacology＆ Toxicology，2001(2):53-58．

［9］OSBORNE D J，HUFFW E，HAMILTON PB，et al．Comparison of ochratoxin，aflatoxin，and T-2 toxin for their effects on selected parameters related to digestion and evidence for specific metabolism of carotenoids in chickens［J］．Poultry Science，1982(8):1646-1652．

［10］LESSON S，DIAZG，SUMMERSJ．Poultry Metabolic Disorders and Mycotoxins［M］．Montreal Canada:University Books，1995．

［11］FREEMAN B A，CRAPO J D．Hyperoxia increases oxygen radical production in rat lungs and lung mitochondria［J］．The Journal of Biological Chemistry，1981(21):10986-10992．

［12］YENER Z，CELIK I，ILHAN F，et al．Effects of Urtica dioica L．seed on lipid peroxidation，antioxidants and liver pathology in aflatoxin-induced tissue injury in rats［J］．Food Chem Toxicol，2009(2):418-424．

［13］MEISSONNIERGM，PINTON P，LAFFITTE J，et al．Immunotoxicity of aflatoxin B1:impairment of the cell-mediated response to vaccine antigen and modulation of cytokineexpression［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2008(2):142-149．

［14］PANANGALA V S，GIAMBRONE J J，DIENER U L，et al．Effects of aflatoxin on the growth performance and immune responses of weanling swine［J］．American Journal of Veterinary Research，1986(9):2062-2067．

［15］VANHEUGTEN E，SPEARS J W，COFFEY M T，et al．The effect of methionine and aflatoxin on immune function in weanling pigs［J］．Journal of Animal Science，1994(3):658-664．

［16］MARY V S，THEUMER M G，ARIASSL，et al．Reactive oxygen species sources and biomolecular oxidative damage induced by aflatoxin B1 and fumonisin B1 in rat spleen mononuclear cells［J］．Toxicology，2012(2/3):299-307．

［17］DWIVEDI N，FLORA G，KUSHWAHA P，et al．Alpha-lipoic acid protects oxidative stress，changes in cholinergic system and tissue histopathology during co-exposure to arsenic-dichlorvos in rats［J］．Environ Toxicol Pharmacol，2014(1):7-23．

［18］BHAT I A，NAYKOON A，QASIM I，et al．Association of interleukin 1 beta(IL-1β)polymorphism with mRNA expression and risk of non small cell lung cancer［J］．Meta Gene，2014，41:123-133．

［19］RINCON M．Interleukin-6:from an inflammatory marker to a target for inflammatory diseases［J］．Trends Immunol，2012(11):571-577．

［20］高炳豪．TNF在炎症中的作用［J］．医师进修杂志，1999，22(11):55-56．

［21］WILSON M R，CHOUDHURY S，TAKATA M．Pulmonary inflammation induced by high-stretch ventilation is mediated by tumor necrosis factor signaling in mice［J］．American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2005(4):599-607．