北京白羽鹌鹑微卫星多态性分析

庞有志， 白俊艳， 张小辉， 赵淑娟， 吴胜军， 于美琴， 许华伟

(河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003)

微卫星(Microsatellite)又称简单重复序列，是一种以2～6 bp核苷酸为基本单位，呈串联重复随机分布于原核和真核生物基因组中的高度重复序列［1-4］。微卫星标记具有多态性丰富且在基因组中分布均匀、检测方便和共显性遗传等优点。在鹌鹑遗传育种方面微卫星标记主要应用于遗传图谱的构建［5］、鹌鹑功能基因和 QTL 定位［6］、遗传多样性分析［7］等方面。北京白羽鹌鹑是朝鲜鹌鹑的一个突变系，是中国自行培育的高产蛋用品系，因其白羽性状具有性连锁遗传的特点，该品系作为配套系的父本，与朝鲜鹌鹑、中国黄羽鹌鹑广泛用于自别雌雄配套系生产［8］。本研究利用9对微卫星标记对北京白羽鹌鹑群体进行多态性检测，旨在为北京白羽鹌鹑的遗传资源的评价、保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 在河南科技大学试验牧场，随机抽取80只北京白羽鹌鹑，每只心脏采血2 ml，血样采用柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，血液∶ACD为6∶1(体积比)。－20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 引物的选择及合成 从国内外文献上筛选多态性比较高且每个基因座至少有4个等位基因的微卫星基因座，确定了9个微卫星基因座作为本次研究的遗传标记(表1)。引物序列送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 9个微卫星基因座的相关信息Table 1 Information for 9 microsatellite loci

1.2 方法

1.2.1 PCR反应条件 PCR反应体系总体积为12.50 μl，其中 ddH2O 8.65 μl，10 × Buffer 1.25 μl，Mg2+(25 mmol/L)0.75 μl，DNA 模板 0.50 μl，上、下游引物各0.50 μl(10 mmol/L)，dNTPs 0.25 μl，Taq酶0.10μl。PCR扩增反应程序:95℃预变性3 min;94℃变性45 s，根据表1的退火温度退火60 s，72℃延伸60 s，30次循环;最后72℃延伸12 min，4℃保存。

1.2.2 扩增产物的检测及聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增产物用1.0×TBE电泳缓冲液配制成的1%琼脂糖凝胶进行检测。以DNA marker I作对照，在紫外透射分析仪上观察，选择特异性条带明亮而且杂带很少的样品，进行8%非变性丙烯酰胺凝胶电泳检测，120 V电泳2 h左右，硝酸银染色后用成像仪拍照保存并分析。根据标准pBR322DNA/MspⅠMarker，检测等位基因片段大小，确定各微卫星基因座全部个体的基因型。

1.2.3 统计分析 通过分子生物学软件POPGENE(Version1.32)分析每个基因座的多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)、杂合度(H)。

2 结果

2.1 微卫星基因座聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

9个微卫星基因座在北京白羽鹌鹑群体中均具有明显的多态性，其中微卫星基因座GUJ0028和GUJ0029电泳图结果见图1、图2。从图1、图2可以看出微卫星基因座GUJ0028和GUJ0029具有丰富的多态性。

图1 微卫星基因座GUJ0028的PCR产物电泳图Fig.1 Banding patterns of PCR product of GUJ0028 microsatelite

图2 微卫星基因座GUJ0029的PCR产物电泳图Fig.2 Banding patterns of PCR product of GUJ0029 microsatelite

2.2 微卫星等位基因数及基因频率

9个微卫星基因座在北京白羽鹌鹑群体中共检测到43个等位基因，平均等位基因数为4.777 8(表2)。其中 GUJ0023、GUJ0029、GUJ0077均检测到 6个等位基因，基因片段分别为 219～244 bp、147～175 bp、260 ～ 285 bp;GUJ0028、GUJ0057、GUJ0097均检测到5个等位基因，基因片段分别为160～185 bp、147～170 bp、130～170 bp;GUJ083检测到4个等位基因，基因片段为 130～155 bp;GUJ059和GUJ0063均检测到3个等位基因，基因片段分别为240 ～246 bp、242 ～246 bp。

微卫星位点 GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083 和GUJ0097在北京白羽鹌鹑群体中分别有15、12、15、13、9、4、14、9、17 种基因型。GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和 GUJ0097优势基因分别为 240、170、175、160、246、244、280、147、155，优势基因型分别为242/238、185/170、175/160、162/162、246/246、244/244、280/280、147/147、155/155。

表2 9个微卫星的等位基因大小和频率Table 2 Allele size and frequencies of 9 microsatellite loci

2.3 微卫星基因座的基因杂合度和多态信息含量

由表3可以看出，在北京白羽鹌鹑群体中微卫星基因座GUJ0023多态信息含量、有效等位基因数和杂合度均为最高，分别为0.751 9、4.659 8和0.785 4。9个微卫星在北京白羽鹌鹑群体中平均多态信息含量、有效等位基因数、杂合度分别为0.658 7、3.613 5、0.704 6。GUJ0023 和 GUJ0029 在白羽鹌鹑群体中的χ2值小于χ20.01，符合哈迪-温伯格定律，其余均偏离哈迪-温伯格平衡定律。

表3 9个微卫星的等位基因数、多态信息含量、有效等位基因数、杂合度Table 3 Number of alleles，polymorphism information content(PIC)，effective alleles and heterozygosity of 9 microsatelliate loci

3 讨论

有效等位基因数是纯合度的倒数，反映微卫星位点上所有等位基因之间的相互影响程度。有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀。本研究中9个微卫星标记在北京白羽鹌鹑群体中有效等位基因数最小为2.103 0，最大达4.659 8，反映出9个微卫星标记的等位基因在群体中分布不均匀。

多态信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多态性的理想指标，当PIC≥0.50时表明该基因座为高度多态基因座，0.25≤PIC＜0.50时表明该基因座为中度多态基因座，PIC＜0.25时表明该基因座为低度多态基因座［9］。本研究中除了GUJ063(PIC=0.463 9)在北京白羽鹌鹑群体中为中度多态性基因座外，其余8个微卫星基因座均为高度多态基因座，表明这8个微卫星标记均可以作为北京白羽鹌鹑群体的有效遗传标记进行遗传多样性分析。

遗传杂合度表示在微卫星基因座上杂合子个体占群体的比例，它反映微卫星基因座在群体中的遗传变异程度。杂合度越高，表明群体内遗传多样性就越高，遗传变异程度就越大，反之则群体内遗传变异程度就小。吴胜军等［10］用同样的9个微卫星标记研究了朝鲜鹌鹑群体的遗传多样性，其平均杂合度为0.709 6，平均多态信息含量为0.663 9，而本研究中北京白羽鹌鹑的平均杂合度和多态信息含量分别为0.704 6和0.658 7，可以看出北京白羽鹌鹑的变异程度略低于朝鲜鹌鹑，这可能与北京白羽鹌鹑所受到较高的选择强度有关。北京白羽鹌鹑由朝鲜鹌鹑分化而来，培育至今已有20余年，比较两者优势基因即可以看出两群体分化的差异，在所研究的9个微卫星基因座中，北京白羽鹌鹑在GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097基因座优势基因分别为 240、170、175、160、246、244、280、147、155;而朝鲜鹌鹑除GUJ0063和GUJ0083两个基因座与北京白羽鹌鹑具有相同的优势基因外，其他7个微卫星基因座优势基因都发生了变化，这提示我们北京白羽鹌鹑从朝鲜鹌鹑分离纯化后发生了一些群体变化，而且这种变化在Bai等［11］对朝鲜鹌鹑的另一种羽色突变系—中国黄羽鹌鹑的研究中也得到反映。另外，孟庆美等［12］报道了朝鲜鹌鹑群体中12个微卫星的多态性，本研究检测的9个微卫星中有5个(GUJ0023、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063 和GUJ0097)与其基因座相同，但检测到的基因数不同，其中有 3个标记(GUJ0057、GUJ0063和GUJ0097)的等位基因数少于其研究结果，而另2个基因座等位基因数多于其研究结果。Farrag等［13］研究的13个微卫星在3个日本鹌鹑品系中的平均杂合度为0.609 0，Hossein等［14］研究的12 个微卫星在日本鹌鹑4个品系中的平均杂合度为0.434 3左右，而本研究的9个微卫星在北京白羽鹌鹑群体中平均杂合度为0.704 6，表明北京白羽鹌鹑群体的遗传变异程度明显高于日本鹌鹑。

χ2检验结果表明，本研究测定的9个微卫星基因座中除GUJ0023和GUJ0029外，其余7个基因座在北京白羽鹌鹑群体中均极显著偏离遗传平衡(P＜0.01)。遗传平衡与否与检测样本数有一定关系，样本不够大时，有些基因座就可能检测不到全部等位基因。Baker等［15］指出，在检测每个品种时，为了避免出现误差，样本数应达到50个。就本研究而言，样本数(80)已经达到抽样要求，表明遗传不平衡不是样本的原因，很可能是北京白羽鹌鹑群体受到过度人工选择或近亲繁殖等因素的影响，这可能与近年来对北京白羽鹌鹑进行小群体保种有关。

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