猪RELMβ基因启动子区克隆及序列分析

陈 哲， 雷明明， 于建宁， 王公金， 施振旦

(江苏省农业科学院畜牧研究所，动物品种改良与繁育重点实验室，江苏 南京 210014)

抵抗素样 β(Resistin-like molecule β，RELMβ)是抵抗素样家族(Resistin-like molecules，RELMs)一员，RELMs共有 4个成员，分别是 RELMα、RELMβ、resistin和RELMγ，该家族成员在C端信号区内含有独特的10到11个半保守的半胱氨酸残基，可通过二硫键形成低聚分子［1］。RELMs在糖尿病、炎症反应、免疫反应和细胞增殖方面都有相关作用［2］。RELMβ又称发现于炎症带2(Found in inflammatory zone 2，FIZZ2)，最初是在啮齿类和人类的胃肠道发现，在近端和远端结肠表达量最为丰富［3］。

研究发现，RELMβ可由肠道杯状细胞产生，并作为Th2细胞因子诱导的免疫效应因子，参与胃肠道感染的耐受［4］。RELMβ可以通过依赖 IL-4(Interleukin 4)和IL-13的调控途径产生抗寄生虫作用［5］，同时还可直接与寄生虫的化学感受部位结合，干扰寄生虫营养供给，起到蠕虫抑制剂的作用［6］。此外，RELMβ还可以通过上调肠道先天免疫因子MUC2的转录水平和蛋白表达水平，保护肠道粘膜屏障的完整性［7］。RELMβ作为一个免疫相关的重要候选基因，对畜禽健康具有重要意义。

目前对RELMβ的功能有了较为广泛的研究，但其表达调控机制尚不十分清晰。本研究利用荧光素酶报告基因系统，对猪RELMβ基因启动子进行结构和活性分析，找到RELMβ基因启动子的核心调控区域，为进一步研究猪RELMβ基因表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

Premix Taq 酶、T4 DNA 连接酶、DNA marker、内切酶、琼脂糖回收纯化试剂盒、小提质粒提取试剂盒、中提质粒提取试剂盒购自宝生物(大连)有限公司，克隆所用菌株DH5α为本实验室保存，pGL3-basic、pGL3-Enhancer、pRL-Tk 载体和双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，人胚肾细胞株293T、人结肠腺癌细胞株HT29购自凯基生物(南京)，Lipo LTX、Opti-MEM、DMEM培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司，引物合成及DNA测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 使用 GPMiner(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预 测RELMβ基因 5'端转录起始位点 TSS;使用 TFSEARCH 在线软件(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和 Genomatix MatInspector(http://www.genomatrix.de/cqi-bin)对潜在转录因子结合位点进行预测;使用NCBI网站Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)序列分析软件对猪、人(NCBI登录号:NT_005612)和小鼠(NCBI登录号:NT_039624)启动子序列进行多重比对，比较同源性;使用Primer6.0软件里的Motif模块进行TATA-box(识别序列TATAWAW，W代表A或T)、CAAT-box(识别序列 CCAAT)和 GC-box(识别序列GGGCGG)位点预测。

1.2.2 引物设计和PCR 根据GenBank获得的人RELMβ基因(登录号:NT_005612)序列以及猪RELMβ基因mRNA序列(登录号:NM_001103210)，结合引物设计原则，采用Primer 6.0软件自行设计6对PCR引物序列(表1)，并在上下游引物引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位点。在0.2 ml PCR反应管中加入 Premix Taq 12.5 μl，DNA 模板1 μl，上下游引物各1μl，无菌去离子水9.5μl。PCR反应条件:98℃预变性3 min;98℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环36次，最后产物在72℃延伸10 min。

表1 扩增RELMβ基因启动子片段引物Table 1 Primers designed for amplifying promoter segments of porcine RELMβgene

1.2.3 报告基因载体构建 将PCR反应获得的不同长度启动子片段纯化，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶回收、T4 DNA连接酶连接后，定向克隆到报告基因载体pGL3-Enhancer中，利用NheⅠ和XhoⅠ双酶切和测序方法，筛选构建正确的重组猪RELMβ基因启动子荧光素酶报告质粒。

1.2.4 细胞培养和瞬时转染试验 用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml)的DMEM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养胚肾293T细胞、人结肠腺癌细胞 HT29，0.25%胰酶消化液消化传代，每2 d传代1次。

接种293T、HT29细胞于96孔板，当细胞生长至汇合率 70%～80%时，将构建的pGLRELMβ-Enhancer系列缺失片段荧光素酶报告载体采用脂质体Lipo LTX转染到以上细胞内，作为试验组，同时转染 pGL3-basic为阴性对照组，pRL-TK为内参质粒，试验重复3次，每组3个平行试验。基因瞬时转染参照Lipofectamine LTX试剂盒说明书进行。

1.2.5 双荧光素酶活性分析 转染24 h后，收集细胞，加入30μl细胞裂解缓冲液，室温摇晃15 min后，吹打细胞，收集裂解液至96孔白板，加入100μl荧光素酶分析剂(LARⅡ)，放置发光检测仪Glomax(Promega)中，测定Firefly荧光素酶活性(M1)，然后再加入100μl Stop＆Glo reagent，测定内参质粒中Renilla荧光素酶活性(M2)，计算荧光素酶相对活性(M1/M2)。

1.2.6 数据统计分析 不同缺失片段启动子活性值之间的比较在Excel中进行，统计方法使用t检验。

2 结果

2.1 猪RELMβ基因启动子系列缺失片段的扩增

通过PCR分别得到1 057 bp(－842～+215)、1 008 bp(－793～ +215)、789 bp(－574～ +215)、397 bp(－182～ +215)、362 bp(－147～ +215)和301 bp(－86～+215)的启动子片段。PCR产物经凝胶电泳检测显示扩增长度符合预期，重组报告载体经过NheⅠ和XhoⅠ双酶切和DNA测序验证，不同长度RELMβ启动子报告基因载体构建成功(图1)。

2.2 猪RELMβ基因启动子序列生物信息学分析

图1 重组RELMβ基因报告载体双酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant RELMβ gene report plasmid by double enzyme digestion

对猪RELMβ基因5'端序列进行在线生物信息学分析发现，猪RELMβ基因启动子区存在1处TATA box，1 处 CAAT box，无 GC box。GPMiner在线分析预测猪和人RELMβ基因转录起始位点在－556 bp和－487 bp处。截取猪、人(NCBI登录号:NT_005612)、小鼠(NCBI登录号:NT_039624)的RELMβ基因起始密码子前842 bp启动子序列进行多重比对发现，猪和人的同源性是34.9%，猪和小鼠的同源性是82.4%。

尽管猪和人之间RELMβ基因启动子序列保守性较低，结合TFSEARCH和Genomatix MatInspector预测猪RELMβ基因启动子转录因子结合位点，比较发现，猪和人RELMβ基因启动子区还是存在许多保守的潜在转录因子结合位点，包括 Cdx2，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF等(图2)。

2.3 猪RELMβ基因启动子活性分析

将构建的 pGL-RELMβ(－842～ +215)、pGLRELMβ(－793～ +215)、pGL-RELMβ (－574～+215)、pGL-RELMβ(－182～ +215)、pGL-RELMβ(－147～+215)和 pGL-RELMβ(－86～ +215)启动子报告载体分别转染至HT29和293T细胞，双荧光素酶报告基因检测结果表明:不同长度RELMβ启动子在HT29和293T细胞均具有活性，且在2个细胞系中，pGL-RELMβ(－574～+215)活性均为最强，显著高于其他报告质粒的活性(P＜0.01)。从pGL-RELMβ (－574～ +215)到 pGL-RELMβ(－182～+215)的相对荧光值下降幅度最大，推测在－574～－182位点存在RELMβ基因启动子的关键顺式调控元件(图3)。

图2 猪和人RELMβ基因启动子序列比较分析Fig.2 Alignment of RELMβ gene promoter sequence of swine and human

图3 RELMβ基因启动子不同片段在细胞系内的相对荧光素酶活性Fig.3 Activities of different segments of RELMβ promoter in HT29 and 293T cells

3 讨论

肠道是能量摄取和营养吸收器官，也是重要的内分泌器官，RELMβ参与肠道内葡萄糖转运、胰岛素抵抗等生理功能。RELMβ通过GLUT2表达量和活性的增强提高空肠内葡萄糖的吸收［8］;小鼠试验发现RELMβ基因可能是营养因素诱导的胰岛素抵抗行为的重要调节因子［9］，进一步的研究结果表明，RELMβ可能通过P38/MAPK途径参与胰岛素信号通路［10］。目前RELMβ已成为研究肠道疾患和评估肥胖型胰岛素抵抗的新靶标［10-11］。

为探讨RELMβ基因转录调控机制，本研究通过PCR方法从猪DNA获得RELMβ基因上游－842～+215 bp的启动子序列，进而构建了不同长度的RELMβ启动子重组报告质粒，发现－574～+215 bp活性最强，在－574～－182 bp区域存在RELMβ基因启动子的关键顺式调控元件，TFSEARCH和Genomatix Mat Inspector软件分析这一区域(匹配率参数分别设为90和0.9)，发现 SRY、Cdx2、GATA-1 和 MZF1 匹配率较高。性别决定转录因子(SRY)是一类含有HMG-box DNA结合区的转录因子，在睾丸特异性表达，在肠道组织的表达还未发现，因此本研究得到的SRY结合位点可能是同样含有HMG-box DNA结合区的类SRY基因，又称SOX基因，Rath等研究SMP30基因(在肝细胞和肾小管上皮细胞特异性表达)启动子区活性也发现相似的现象［12］。SOX基因是一类与发育相关的基因，部分SOX基因(如SOX17)可以通过Wnt信号通路抑制与结肠癌细胞的生长与分裂有关的靶基因表达［13］。尾型同源盒转录因子2(Cdx2)仅在成体肠道中表达，是肠特异性转录因子，在肠上皮发育以及肠表型分化和维持中起到重要作用［14］，研究还发现，Cdx2可以特异性结合于黏液蛋白因子MUC2的启动子，提高MUC2的表达水平［15］。郑丽端等在人RELMβ基因启动子区发现核心调控元件Cdx2能显著增强启动子活性［11］，进一步证明Cdx2在调控哺乳动物RELMβ基因启动子活性中起到重要作用。髓样锌指蛋白1(MZF-1)通过调节蛋白激酶C-alpha的转录活性参与细胞的增殖、分化、转化和凋亡［16］，Chelbi等研究发现MZF-1是SERPINA3基因启动子转录激活过程不可缺少的转录因子，MZF-1结合在SERPINA3基因启动子区结合位点可以激活其抗菌防御作用［17］。GATA家族是一类含锌指结构的转录调节因子，在胚胎发育时期能促进胃肠道的正常发育，并有助于在成年肠上皮细胞的不断更新中调节组织分化，在体内，GATA-1和c-Myb的相互作用会抑制GATA-1与DNA的结合，转录因子GATA-1和c-Myb相互抑制各自的转录活性［18］，本研究中猪RELMβ基因启动子区包含GATA-1和c-Myb结合位点，说明GATA-1和c-Myb很有可能参与了RELMβ基因的转录调控。

猪和人RELMβ基因启动子区都存在CdxA，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF1等转录因子结合位点，说明抵抗素样家族的转录调控模式在进化上有保守性。下一步工作将通过定点突变和缺失等方法进一步探究RELMβ基因的核心启动子及其转录活性受哪些转录因子影响。

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