短串联重复序列基因座在石蜡包埋组织中的应用

赖 力，韩莉莉，沈晓丽

(福建省立医院司法鉴定所/福建省心血管病重点实验室/福建医科大学省立临床学院,福州 350001)



·论 著·

短串联重复序列基因座在石蜡包埋组织中的应用

赖 力，韩莉莉，沈晓丽△

(福建省立医院司法鉴定所/福建省心血管病重点实验室/福建医科大学省立临床学院,福州 350001)

目的 探讨3种STR基因座分型系统在石蜡包埋组织基因座分型的差异。方法 采用Qiagen 法对保存1个月的石蜡包埋组织进行DNA提取，用Identifiler系统、PowerPlex 21系统及Investigator HDplex系统对STR基因座进行聚合酶链反应复合扩增、毛细管电泳、荧光检测及片段分析，比较3种系统的STR基因座检出率，并且采集组织同一个体的血液、毛发、口腔拭子等样本进行STR基因座分型，比较同一个体不同器官组织STR基因座分型的差异。结果 经紫外分光光度计测定石蜡包埋组织的DNA浓度为6～85 ng/μL，纯度1.7～2.2，Identifiler系统能够在DNA浓度大于15 ng/μL时得到完整的基因座分型，PowerPlex 21系统在DNA浓度为85 ng/μL时得到完整的基因座分型，而HDplex系统在石蜡组织检测中均未获得完整的基因座分型。石蜡包埋组织与其他器官组织分型结果存在差异，其中D6S474、D4S2366和D21S2055基因座存在等位基因不平衡或基因座丢失现象。结论 石蜡包埋组织中DNA的浓度和纯度是STR基因座分型的重要影响因素，遗传信息丢失现象与检验对象的性状有关，也与所采用的检测系统有关，Identifiler系统对石蜡包埋组织的STR基因座分型具有较高的实用价值。

石蜡包埋组织； STR分型； 个体识别

石蜡包埋组织(FFPET)是病理学、法医病理学进行疾病诊断和科学研究的常用检验材料，是医院病理科和法医鉴定机构的常规档案保存材料，能够满足长期保存的要求。在某些特殊情况下，FFPET能够作为涉嫌保险欺诈、调错病理标本的医疗纠纷及亲权司法鉴定和个体识别等案件的重要检验材料。但由于在对组织进行石蜡包埋过程中，常规使用甲醛对组织进行固定，而甲醛会对组织中DNA造成化学损伤，使DNA降解比较严重。有研究报道，组织用10%甲醛固定时间超过1周，蛋白和DNA的交联作用就会使核酸破坏，嘌呤基的β糖苷键发生水解使DNA断裂破坏[1-2]。目前国内外不少学者致力于研究从FFPET中取得高质量DNA的方法，但并不能给FFPET基因分型带来本质性改观。本研究系统分析FFPET的常见STR基因座分型检出情况，旨在探讨常见STR基因座分型系统用于FFPET分型的应对策略，并且比较FFPET与同一个体其他组织器官样本的基因座分型情况，探讨其在个体识别中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 系统与仪器 QIAamp®RDNA FFPE Tissue 系统盒(德国Qiagen公司产品)、AmpFISTR Identifiler系统盒(美国AB公司产品)、PowerPlex 21系统盒(美国Promega公司产品)、Investigator HDplex系统盒(德国Qiagen公司产品)、微量紫外分光光度计 ND-1000(美国NanoDrop公司产品)、AB 9700型聚合酶链反应(PCR)扩增仪及AB 3130基因分析仪(美国AB公司产品)。

1.2 样品 某医院送检FFPET切片6份，组织来源于某患者的肠道肿瘤组织。活检组织样本用10%甲醛固定，24 h内按标准程序取样，制备成FFPET，于室温下保存1个月，制作4～5 μm的FFPET切片。另外取该患者的血样5 μL、带毛囊的毛发1根及口腔拭子1份作为对照。

1.3 样品预处理 将6份FFPET切片标记为组织1、2、3、4、5、6，分别装入6个离心管中，各加入1 mL二甲苯，混匀后剧烈振荡10 s。全速离心2 min弃上清液，再加入1 mL无水乙醇振荡混匀，全速离心2 min后弃上清液，沉淀放置室温中挥发残存乙醇。

1.4 DNA提取 FFPET使用Qiagen法提取DNA，操作严格按照使用手册进行。组织身源者的血样、毛发及口腔拭子的DNA提取采用Chelex 法，操作步骤参照亲权鉴定技术规范(SF/Z JD0105001-2010)执行。所获得的DNA样品经过微量紫外分光光度计ND-1000进行定量及纯度分析,对浓度最高FFPET的DNA进行半定量稀释并检测稀释后的浓度。

1.5 STR基因座检测 6份FFPET的DNA样品及血样、毛发、口腔拭子DNA样品均取1 μL DNA作为模板，分别采用AmpFISTR Identifiler系统盒、PowerPlex 21系统盒及Investigator HDplex系统盒等3种分型系统进行STR基因座的复合扩增，参照系统说明书配制PCR反应体系。3种系统的扩增产物通过3130基因分析仪进行毛细管电泳，Data collection软件收集荧光信号及GeneMapper ID V3.2软件对STR基因座进行分型，分别以LIZ 500、ILS500及BTO550内标作为对照，以各色荧光峰值振幅阈值大于50为筛选标准，确定检出的基因座峰型。检测3种系统总共30个常见的STR基因座，观察基因座检出情况，并且比较FFPET与其身源其他组织在基因座分型上的差异。

2 结 果

2.1 DNA定量结果 见表1。FFPET的DNA样品(组织1～6)及血样、毛发、口腔拭子的DNA样品均获得超过1 ng/μL的浓度。石蜡组织DNA样品的纯度A260/A280位于1.7～2.2。血样、毛发、口腔拭子DNA样品的纯度为1.2～1.5。

表1 检测样品DNA定量结果

注：/表示未检测。

2.2 常见STR基因座分型系统的分型结果 Identifiler系统包括15个STR基因座，PowerPlex 21系统包括20个STR基因座，HDplex系统包括12个STR基因座，3种系统均具有1个性别基因座Amelogenin。当基因座的基因型为纯合子基因型时，分型图谱上显示1条峰，如果为杂合子基因型则显示2条峰。组织1、2、3用Identifiler系统检测，16个基因座均能全部检出，基因座检出率为100%，而组织4～6的基因座检出率为50%～81%；当使用PowerPlex 21系统分型，仅组织2能够检出全部基因座，组织3～6的基因座检出率为52%～90%；在使用HDplex系统分型时，6个组织均未获得完整的基因座分型结果，基因座检出率为46%～92%。6份FFPET的DNA样品在3种系统的基因座分型上均能得到全部完整的峰型，且分型结果一致(表2)。组织2的基因座分型结果与正常组织分型结果最为接近，在检测的常见30个STR基因座中有27个基因座的分型结果与其他器官组织一致，仅存在D6S474、D4S2366基因座部分等位基因丢失和D21S2055基因座全部丢失(表3)。在检出全部基因座的分型图谱上，各STR基因座分型峰高并不均匀，大片段基因座峰高偏矮，小片段基因座峰高不均一。在未能检出全部基因座的分型图谱上，本文发现均存在大片段STR基因座等位基因的丢失，而且随着DNA浓度降低，丢失的基因座数目逐渐增加，小于200 bp长度的小片段基因座能够获得较好的分型结果，而250 bp以上的大片段基因座分型存在异常，出现等位基因不平衡扩增及基因座丢失乃至无结果等现象。

表2 6份FFPET的DNA样品在3种系统的基因座检出结果[n(%)]

表3 30个STR基因座在组织2与血样、毛发、口腔拭子的基因座分型结果

续表3 30个STR基因座在组织2与血样、毛发、口腔拭子的基因座分型结果

注：下划线部分为存在异常分型的基因座，只检出部分基因型，其余为纯合子基因型，2条染色体等位基因相同；-表示无数据。

3 讨 论

根据人群DNA片段中的STR基因座具有高度多态性且同一个体各组织器官具有同源性等特点，可以利用STR基因座对个体和生物学检验材料进行同一认定。由于单个STR基因座的遗传信息有限，所以目前个体识别和亲权鉴定领域的主要检测手段是多个STR基因座组成的检测系统，其检验策略是收集尽可能多的STR基因座遗传信息以提高检测系统的个体识别能力。

本研究选择的检测系统有3种，分别是包括16个基因座的Identifiler系统、21个基因座的PowerPlex 21系统及13个基因座的HDplex系统。Identifiler系统是目前国内外通行的STR基因座分型系统，其应用价值已经得到广泛验证[3-4]。PowerPlex 21系统是目前新研制且STR基因座设计比较全面的系统之一，增加了Identifiler系统不具备的且被证实具有高度多态性的基因座D12S391、D6S1043、Penta D及Penta E。HDplex系统是新研制的STR基因座分型系统，融合了多个非CODIS系统的基因座，已被证实适合于群体遗传学研究[5]。PowerPlex 21系统和HDplex系统所研究样本多为常规血样检验材料，未见特殊检验材料方面的应用。在基因座片段大小的分布上，Identifiler系统所有基因座均在400 bp之内，而PowerPlex 21系统由于检测的基因座数目较多，其片段大小均在500 bp之内，HDplex系统虽然基因座数目不多，但是基因座多态性高，等位基因型丰富，故基因座片段大小也在500 bp之内。

FFPET是医院病理科记录患者病情及患者信息溯源的重要个人档案，在医疗纠纷、保险理赔等方面能够成为提供个人信息的重要生物检验材料[6]。组织在石蜡包埋处理前都必须经过10%甲醛固定，甲醛固定时间长短直接影响STR基因座的检验[7]。目前医院病理科由于临床需要，一般在甲醛固定24 h内对组织进行石蜡包埋等处理，最多不超过48 h，短时间的甲醛固定可以最大限度减少甲醛对DNA的降解和破坏。

由于甲醛对DNA的破坏，DNA分子随机降解成小片段，使STR基因座无法检出，从而导致遗传信息的缺失[8]。遗传信息的缺失与检验材料本身有关，也与检验者所采用的分析策略有关。本研究以保存相同时间的FFPET为检验对象，保证了组织甲醛固定时间及石蜡组织保存时间的一致性。DNA提取的方法都选择Qiagen法，Qiagen法使用商业化抽提系统盒，获得的DNA纯度高，无PCR抑制剂，这样保证了每份组织抽提获得的DNA降解程度一致，只是在对切片组织的数量上加以区别及抽提DNA的浓度上进行差异化处理。研究中发现，Identifiler系统相对PowerPlex 21系统、HDplex系统，能够在DNA浓度较低时获得全部完整的基因座分型，其对降解检验材料的DNA适应程度要优于PowerPlex 21系统和HDplex系统。在基因座出现丢失现象的分型图谱中，片段大小在200 bp以内的基因座分型结果正常，在200～300 bp范围内的基因座分型出现程度不等的等位基因扩增不平衡及等位基因丢失现象，而大于300 bp的基因座分型基本上都存在丢失。Identifiler系统大部分基因座都位于300 bp以内，基因座的检出率是3个系统中最高的，由此可见对固定时间短，DNA降解程度不大的FFPET进行STR基因座分型，Identifiler系统相对其他常用系统能够获得较好的分型结果。林旭等[9]运用Identifiler系统对硅珠法提取FFPET的DNA质量评估，在46例(93%)得出完整16个基因座峰型，既验证了硅珠法提取组织DNA的优势，也验证了Identifler系统适合于FFPET的基因座分型。张越等[10]将多重置换扩增技术(MDA)应用于病理切片的DNA分型，认为MDA可提高病理切片模板基因组量，相对降低PCR 扩增抑制物浓度，减少等位基因脱扣现象，有效提高了基因座检出率。

本研究发现，FFPET与其身源者其他器官组织STR基因座分型结果存在一定差异，FFPET中D6S474基因座检出基因型13、D4S2366基因座检出基因型11、D21S2055基因座未检出基因型，而其身源者的血液、毛发及口腔拭子中脱落细胞的STR基因座分型均检出D6S474基因型13/14、D4S2366基因型9/11、D21S2055基因型25/35。导致上述组织中STR基因座存在差异的原因可能是由于肿瘤组织中STR基因座的变异，包括了完全杂合性丢失和部分杂合性丢失等，也可能是由于本身组织DNA降解破坏后大片段基因座的扩增受到影响[11]。鉴于在已检出的常见STR基因座中，FFPET与其他器官组织的分型结果一致，且异常基因座均为大片段基因座，故考虑基因座的差异系组织DNA降解造成的可能性较大。

在日常鉴定检测工作中，时常需要对特殊检验材料进行STR基因座分型，除了要慎重选择标本处理方法外，所采用的检测系统也是至关重要的因素。MiniFiler系统由一系列小片段STR基因座组成，适合于微量降解检验材料，但是在一般实验室未能普及应用，所以使用常见STR基因座分型系统还是实验室的常用方法。本研究发现，Identifiler系统稳定性更高，更适合于微量降解检验材料。

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[10]张越，陈阳，杨元立，等．多重置换扩增在病理切片DNA分型中的应用[J]．法医学杂志，2013，29(1)：17-20．

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Application of short tandem repeats loci genotyping in paraffin embedded tissueLAI

Li，HANLi-li，SHENXiao-li△

(ForensicSciencesInstituteofFujianProvincialHospital/FujianProvincialKeyLaboratoryofCardiovascularDisease/ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,Fuzhou,Fujian350001,China)

Objective To study the difference of the short tandem repeats(STR) loci genotyping in paraffin embedded tissue by using three kits.Methods DNA were extracted from intestinal tumor in paraffin-embedded tissue which was preservd for a month by using Qiagen method,fluorescent multiplex PCR by using identifiler kit,PowerPlex 21 kit and Investigator HDplex kit,capillary electrophoresis and fragment analysis technique were used to detect STR loci.Comparing the recalling rations of STR loci of three kits and the genotype of the homologous normal samples which include paraffin embedded tissue,blood,hair and oral swab.Results DNA concentration extracted from paraffin-embedded tissue were detected between 6-85 ng/μL,OD=1.7-2.2.when DNA concentration >15 ng/μL,the full STR loci genotype was detected by identifiler kit,and when DNA concentration was 85 ng/μL,the full STR loci genotype was detected by PowerPlex 21 kit,however,there was no full peaks of all the STR loci by using HDplex kit.There were several different STR loci genotype between paraffin embedded tissue and other homologous normal samples.There were allelic imbalance and drop-outs in D6S474,D4S2366 and D21S2055.Conclusion The concentration and purity of DNA extracted from paraffin embedded tissue were the important influential factors for STR loci genotype.The phenomenon of missing genetic information was related to sample properties and the detecting system.There was high practical value for STR loci genotyping in paraffin embedded tissue by using identifiler kit.

paraffin embedded tissue; STR typing; individual identification

赖力,男,硕士，主管技师，主要从事法医物证、医学遗传学及心脏标志物检测方面的研究。

△通讯作者,E-mail:sxli3318@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.026

A

1672-9455(2015)03-0352-03

2014-08-28

2014-10-26)