骨肉瘤外周血Runx3基因启动子甲基化检测及临床意义

刘 融，陈令斌，张 勇

(武汉市普仁医院：1.骨二科；2.骨一科 430081)



·临床研究·

骨肉瘤外周血Runx3基因启动子甲基化检测及临床意义

刘 融1，陈令斌2，张 勇1

(武汉市普仁医院：1.骨二科；2.骨一科 430081)

目的 研究骨肉瘤患者外周血Runt相关转录因子3(Runx3)基因启动子甲基化及临床意义。方法 选择骨肉瘤患者及健康人作为研究对象，采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测两组研究对象外周血Runx3基因启动子甲基化并比较其差异，分析骨肉瘤患者Runx3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系。结果 骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化率(57.1%)显著高于健康人(2.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。在不同性别、年龄、肿瘤部位和病理类型的骨肉瘤患者之间，外周血Runx3基因启动子甲基化率的差异无统计学意义(P>0.05)，在不同KPS评分、肿瘤最大径、病理性骨折、组织学分级和Enneking分期的骨肉瘤患者之间，差异均有统计学意义(P<0.05)。KPS评分低于70分、肿瘤最大径大于或等于10 cm、有病理性骨折、组织学分级G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者，其Runx3基因启动子甲基化率显著高于KPS评分大于或等于70分、肿瘤最大径小于10 cm、无病理性骨折、组织学分级G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者。结论 骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子呈高甲基化状态，与KPS评分、肿瘤最大径、病理性骨折、组织学分级和Enneking分期密切相关，可用于评估骨肉瘤患者病情及预后。

骨肉瘤； Runx3； 启动子； 甲基化； 临床意义

骨肉瘤的发病机制尚未完全明确，可能与环境及遗传因素密切相关，遗传因素包括基因突变及表观遗传学改变，其中甲基化异常是表观遗传学最常见的病因，越来越多的基因甲基化被发现参与骨肉瘤的发生和发展[1-2]。Runt相关转录因子3(Runx3)为新近发现的抑癌基因，其甲基化表达失活与胃癌等肿瘤的发病机制紧密相关[3]，但在骨肉瘤中报道较少。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年1月至2014年6月诊治的骨肉瘤患者为研究对象，纳入标准：(1)初次就诊，既往未行手术、放疗或化疗等治疗；(2)均经X射线、CT、磁共振成像(MRI)和病理组织学检查确诊；(3)排除合并其他肿瘤及多发患者。本组骨肉瘤患者共纳入70例，包括男43例，女27例；平均(24.1±5.8)岁。另选择门诊行健康体检的健康者50例为对照，其中男30例，女20例；平均(24.5±6.1)岁。两组研究对象在性别组成和年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 Runx3基因启动子甲基化检测 骨肉瘤患者和健康者空腹8 h后取静脉血检测Runx3基因启动子甲基化，检测方法为MS-PCR。采用MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设计MS-PCR引物，见表1，反应体系为25 μL，循环条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1 min，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环后最后一轮72 ℃延伸10 min。MS-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。

表1 Runx3基因启动子甲基化MS-PCR检测引物序列

1.3 统计学处理 采用SigmaPlot12.0进行统计学分析。不同临床病理因素中Runx3基因启动子甲基化率的差异采用χ2检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Runx3基因启动子甲基化对比 70例骨肉瘤患者中有40例外周血基因启动子检测到甲基化，Runx3基因启动子甲基化率为57.1%；50例健康者中有1例外周血基因启动子检测到甲基化，Runx3基因启动子甲基化率为2.0%，骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化率显著高于健康者(χ2=37.016，P<0.05)。

2.2 Runx3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系 在不同性别、年龄、肿瘤部位和病理类型的骨肉瘤患者之间，外周血Runx3基因启动子甲基化率的差异无统计学意义(P>0.05)，在不同KPS评分、肿瘤最大径、病理性骨折、组织学分级和Enneking分期的骨肉瘤患者之间，差异均有统计学意义(P<0.05)。KPS评分低于70分、肿瘤最大径大于或等于10 cm、有病理性骨折、组织学分级G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者Runx3基因启动子甲基化率显著高于KPS评分大于或等于70分、肿瘤最大径小于10 cm、无病理性骨折、组织学分级G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者，见表2。

表2 不同临床病理因素骨肉瘤患者中Runx3基因启动子甲基化率比较(n)

续表2 不同临床病理因素骨肉瘤患者中Runx3基因启动子甲基化率比较(n)

3 讨 论

骨肉瘤的发病机制尚未完全明确，主要与基因突变及表观遗传学等遗传因素有关，表观遗传学因素主要包括甲基化，越来越多的基因甲基化表达沉默被证实参与了肿瘤的发生和发展[4]。甲基化不依赖于DNA碱基突变，自身结构或结合甲基结合蛋白可调控基因表达，为基因转录前调控最常见的作用机制[5]，在越来越多的肿瘤中检测到甲基化改变，在肿瘤的早期诊断、病情及预后评估中扮演重要角色[6]。Runx3基因是新近发现的抑癌基因，主要通过调控TGF-β信号传导通路而发挥调控细胞周期的功能，其表达水平下降导致正常细胞失去调控而发生癌变，在越来越多的肿瘤中可检测到Runx3基因的甲基化表达失活状态[7]。研究表明，与Runx3基因同家族的Runx2基因在骨肉瘤组织中mRNA表达低于健康人[8]，进一步研究发现其处于高甲基化沉默状态，基于Runx3基因与Runx2基因功能类似，推测Runx3基因启动子甲基化可能与骨肉瘤的发病机制密切相关。本研究中骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化率(57.1%)显著高于健康者(2.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)，证实了Runx3基因启动子甲基化与骨肉瘤发病机制的相关性。

在消化系统和生殖系统肿瘤中可检测到Runx3基因的高甲基化状态，进一步发现其甲基化水平与临床病理因素相关，可作为其诊断、病情及预后评估的标志物，较蛋白质标志物具有更高的灵敏度及特异性[9]，基于这些证据，推测Runx3基因启动子甲基化可能与骨肉瘤的病情及预后密切相关。在不同性别、年龄、肿瘤部位和病理类型的骨肉瘤患者之间，外周血Runx3基因启动子甲基化率的差异无统计学意义(P>0.05)；在不同KPS评分、肿瘤最大径、病理性骨折、组织学分级和Enneking分期的骨肉瘤患者之间，差异均有统计学意义(P<0.05)。KPS评分低于70分、肿瘤最大径大于或等于10 cm、有病理性骨折、组织学分级G3+G4及Enneking分期晚的骨肉瘤患者Runx3基因启动子甲基化率显著高于KPS评分大于或等于70分、肿瘤最大径小于10 cm、无病理性骨折、组织学分级G1+G2及Enneking分期早的骨肉瘤患者。这些证据表明，Runx3基因启动子甲基化与其他肿瘤类似，在骨肉瘤的病情及预后评估中扮演重要角色。本研究仅检测骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化，推测骨肉瘤组织中可能存在Runx3基因启动子甲基化状态，与手术切除标本对比，外周血标本可能更具有前瞻性的优点，在临床应用中更具有价值。

吴同申等[9]采用流式细胞仪检测了骨肉瘤中Runx3蛋白质的表达水平，发现Runx3在骨肉瘤中的表达水平明显低于良性肿瘤，骨肉瘤中Runx3表达水平在不同软组织浸润及不同Ennecking分期的比较中有显著差异，说明Runx3蛋白质检测对判断预后有一定价值。进一步研究发现，除Hs888T细胞系的Runx3基因的启动子区域CpG岛可发生广泛甲基化外，MG63、G292、Hs919T、saos2、Hs860T、Hs707A、HOS等细胞系的Runx3启动子区域CpG岛仅发生部分甲基化[10]；实时荧光定量PCR显示，MG63、saos2、G292等骨肉瘤细胞系可见明显的Runx3表达，Hs919T、Hs707A、HOS等骨肉瘤细胞系也有不同程度的Runx3表达，实验结果表明在骨肉瘤细胞系中未见明显的Runx3表达异常，在Runx3启动子区域CpG岛没有发生广泛甲基化等表观遗传学异常改变，但本研究中骨肉瘤患者外周血Runx3基因启动子甲基化率显著高于健康者，证实了Runx3基因启动子甲基化与骨肉瘤发病机制的相关性，与前述研究结论相反，可能与细胞和人体表达不一致有关，有待于进一步研究证实。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.044

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1672-9455(2015)07-0978-02

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2014-11-22)