慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立*

赵 毅，王 燕，胡新荣

(广东医学院基础医学院，广东东莞 523808)



·论 著·

慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立*

赵 毅，王 燕，胡新荣△

(广东医学院基础医学院，广东东莞 523808)

目的 构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法 设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列，以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后，经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采用定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测eIF4E mRNA和蛋白的表达水平；采用细胞增殖和迁徙实验验证eIF4E敲减对CNE2细胞的影响。结果 成功构建并筛选获得带有eIF4E特异性短发夹RNA的慢病毒颗粒；将慢病毒颗粒转入CNE2细胞，经抗菌药物压力筛选获得稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞(CNE2siEp)及阴性对照细胞(CNE2siNC)。与CNE2siNC细胞相比，CNE2siEp细胞eIF4E mRNA表达水平下调76.0%，蛋白表达水平下调50.0%，细胞增殖活性下调85.0%，运动活性下调59.0%。结论 成功构建稳定敲减eIF4E的CNE2细胞系，其eIF4E基因表达水平与功能明显受抑。

真核起始因子4E; 敲减; 慢病毒感染; RNA干扰

真核起始因子4E(eIF4E)是真核生物细胞蛋白质合成步骤中生成翻译起始复合物的必需因子之一[1]。已有研究发现，eIF4E在肺癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤组织中表达水平升高，并与肿瘤转移、治疗后复发等存在一定的关系[2-3]。有研究显示，eIF4E过表达与鼻咽癌的转移和患者预后密切相关，但其作用机制尚未完全明确[4-5]。为研究eIF4E在鼻咽癌增殖、转移中的作用机制，探寻调控鼻咽癌早期转移的分子靶点，需要构建稳定干扰基因表达的鼻咽癌细胞系。慢病毒感染体系是目前常用的能够较为稳定地转染基因克隆的病毒体系之一[6]。慢病毒感染体系感染分裂细胞或非分裂细胞后，可以在细胞内长期表达且安全性较高[7]；结合抗菌药物压力筛选方法，则可用于构建稳定基因过表达与敲减细胞系[8]。构建稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌细胞系有助于更好地探寻eIF4E在鼻咽癌细胞中的作用，分析其参与调控鼻咽癌转移的具体机制。因此，本研究以针对eIF4E基因mRNA的小干扰RNA(siRNA)序列为基础构建了慢病毒感染体系，在对低分化鼻咽癌细胞系CNE2细胞进行感染后分析了eIF4E敲减对鼻咽癌细胞增殖、迁徙活性的影响。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 慢病毒包装质粒pGC-LV、pHelper1.0、pHelper2.0及靶向eIF4E的siRNA片段由上海吉凯基因技术有限公司设计、合成。限制性核酸内切酶及T4连接酶购自美国NEB公司。大肠埃希菌DH5α株及质粒提取试剂盒购自德国Qiagen公司。人胚肾细胞293T及人肺腺癌细胞H1299购自美国模式培养物集存库(ATCC)。CNE2细胞由本实验室保存。trizol试剂和莫洛尼鼠白血病病毒第一链合成试剂购自美国Life Technology公司，转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，定量聚合酶链反应(PCR)检测试剂FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)购自德国Roche公司。放射免疫沉淀裂解缓冲液系统(RIPA Lysis Buffer System)、鼠抗人eIF4E单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruz公司。细胞增殖活性检测CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。Transwell小室(8 μm)购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胚肾细胞293T、人肺腺癌细胞H1299、鼻咽癌低分化细胞CNE2均采用DMEM培养基(含10%胎牛血清及双抗)，37 ℃、5% CO2培养。所有细胞学实验均在细胞传代12代以内进行。

1.2.2 短发夹RNA(shRNA)干扰质粒的构建 参考文献[9]及前期实验结果，针对eIF4E基因3个转录本(NM_001968.3、NM_001130679.1、NM_001130678.1)的同源序列设计靶点，共设计4个RNA干扰靶点序列，包括KD1：5′-AAG GAT GGT ATT GAG CCT ATG-3′；KD2：5′-GAG GAC GAT GGC TAA TTA CAT-3′；KD3：5′-CGG CTG ATC TCC AAG TTT GAT-3′；KD4：5′-CCA CTC TGT AAT AGT TCA GTA-3′。化学合成序列，退火、冷却后与经限制性核酸内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ处理的pGCL-GFP载体连接，转化DH5α感受态细胞，抗性培养基培养后挑选单克隆菌落，经PCR鉴定并测序明确插入序列的方向及完整性，即为干扰质粒pGCLV-eIF4E-shRNA(编号#1～4)。

1.2.3 慢病毒包装 将病毒包装细胞293T以浓度6×105个/毫升接种于15 cm细胞培养皿中，待细胞融合度达70%～80%时用于转染。转染步骤参照试剂说明书。转染8 h后更换新鲜的完全培养基；常规培养48 h后收集含有病毒的细胞培养上清，用0.45 μm滤器去除细胞碎片，离心浓缩用于病毒感染。

1.2.4 慢病毒感染及最佳靶点筛选 选取对数生长期H1299细胞，以浓度5×104个/孔接种六孔板，设置空白对照组、阴性对照组和4个带有干扰序列的病毒干预组(KD1～4)，每组包括3个复孔。常规培养至细胞融合度达到约30%。向病毒干预组和阴性对照组中加入制备好的4组eIF4E-RNAi-LV病毒及阴性对照病毒，空白对照组不加入病毒。感染12 h后更换培养基，感染5 d后提取各组细胞RNA，采用定量PCR检测eIF4E基因表达相对水平，筛选最佳干扰靶点。

1.2.5 抗菌药物筛选与感染细胞培养 以感染H1299细胞的方法感染CNE2细胞，病毒干预组采用经干扰靶点筛选后确定的eIF4E-RNAi-LV-#2病毒，阴性对照组采用阴性对照病毒。感染5 d后更换培养基(含浓度为1.0 μg/mL的嘌呤霉素)，持续观察细胞，每3天更换1次培养基(含新鲜嘌呤霉素的DMEM培养基)，7 d后扩大培养，直至感染后29 d；挑取单克隆细胞，移至新培养皿中扩大培养。eIF4E稳定干扰细胞株命名为CNE2siEp细胞，阴性对照病毒感染细胞命名为CNE2siNC细胞。

1.2.6 eIF4E表达水平检测 采用定量PCR方法检测细胞eIF4E mRNA表达水平，采用免疫印迹法(Western Blot)检测eIF4E蛋白表达水平。

1.2.7 细胞生长周期、增殖活性及迁徙活性检测 采用CCK8试剂盒检测CNE2siEp、CNE2siNC、CNE2细胞生长水平及增殖活性，采用细胞运动实验检测细胞迁徙活性。

1.3 统计学处理 采用Microsoft Excel 2003软件进行数据处理，采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 eIF4E-RNAi-LV慢病毒颗粒最佳干扰靶点筛选 采用4个带有干扰序列的病毒对H1299细胞进行感染，其中KD2(eIF4E-RNAi-LV-#2)、KD3(eIF4E-RNAi-LV-#3)对目的基因eIF4E表达的干扰作用较阴性对照组升高超过85.0%，其中KD2为最有效靶点。因此，采用eIF4E-RNAi-LV-#2病毒进行验证实验。在以CNE2细胞作为靶细胞的病毒感染干扰实验中，KD2组(eIF4E-RNAi-LV-#2病毒干扰)对目的基因eIF4E表达的干扰作用较阴性对照组升高超过70.0%。因此，以eIF4E-RNAi-LV-#2病毒进行后续实验，并将病毒命名为eIF4E-RNAi-LV病毒。

2.2 eIF4E-RNAi-LV病毒感染CNE2细胞对eIF4E表达的影响 CNE2siNC细胞、CNE2细胞eIF4E mRNA相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；CNE2siEp细胞eIF4E mRNA表达水平较CNE2siNC降低76.0%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A。CNE2细胞、CNE2siNC细胞eIF4E蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；CNE2siEp细胞eIF4E蛋白表达水平较CNE2siNC细胞降低50.0%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)有统计学意义，见图1B、C。CNE2siEp细胞eIF4E基因的表达被明显沉默，可用于后续实验。

注：A为各组间eIF4E mRNA相对表达水平比较；B为各研究组eIF4E蛋白Western Blot检测结果；C为各组间eIF4E蛋白相对表达水平比较；**表示组间比较P<0.05。

图1 各研究组细胞eIF4E mRNA及蛋白相对表达水平比较

2.3 eIF4E敲减对CNE2细胞生长周期和增殖活性的影响 CNE2细胞、CNE2siNC细胞生长速度比较差异无统计学意义(P>0.05)；与CNE2siNC细胞比较，CNE2siEp细胞生长速度在培养前5 d明显被抑制，细胞生长速度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A。病毒感染48 h后，CNE2细胞、CNE2siNC细胞增殖活性比较差异无统计学意义(P>0.05)；与CNE2siNC细胞比较，CNE2siEp细胞增殖活性降低85.0%，细胞增殖活性组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。

2.3 eIF4E敲减对CNE2细胞迁徙活性的影响 各研究组细胞运动实验染色检测结果见图3。CNE2细胞、CNE2siNC细胞的穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；与CNE2siNC细胞比较，CNE2siEp细胞的穿膜细胞数降低59.0%，穿膜细胞数组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为各研究组细胞生长曲线；B为各研究组细胞感染48 h后增殖活性比较；**表示组间比较P<0.05。

图2 eIF4E敲减对CNE2细胞生长周期和增殖活性的影响

图3 各研究组细胞运动实验染色检测结果

3 讨 论

RNA干扰是机体抵御外来基因和病毒感染的基因调控方式之一，可通过双链RNA降解同源mRNA，进而在RNA水平抑制基因的表达。RNA干扰具有特异性和高效性的特点，可在核酸水平调控细胞基因的表达[10]。本研究所使用的pGC-LV慢病毒系统以“自杀性改造”为基础，采用三质粒包装构建获得，安全性高、操作简单、感染效率较高，而且能够在体外合成构建siRNA的表达载体shRNA，进而在专用工程细胞293T中结合辅助质粒，表达并包被。经荧光筛选获得可产生shRNA的高滴度慢病毒颗粒，再转移至细胞内转录加工，即可生成siRNA。本研究采用eIF4E-RNAi-LV转染H1299、CNE2细胞，证实了可高效敲减eIF4E表达的siRNA靶点序列。此外，本研究结合抗菌药物压力筛选，成功在相对较短的时间内获得了高纯度的稳定敲减eIF4E的CNE2siEp细胞及其对照细胞CNE2siNC，为进一步研究相关基因功能和细胞生物学行为奠定了基础。

eIF4E可选择性翻译癌基因mRNA，并参与癌蛋白的表达，对细胞转化及肿瘤细胞增殖、侵袭、转移均可能存在影响[1]。然而，eIF4E在鼻咽癌细胞中的表达水平和功能，特别是其参与癌基因表达调控的分子机制尚未完全明确。笔者在前期实验中发现eIF4E蛋白与鼻咽癌细胞增殖、转移密切相关，可能参与了肿瘤上皮介质转化和复发。因此，本研究构建了eIF4E稳定敲减的鼻咽癌低分化细胞系CNE2siEp细胞及其对照细胞。初步细胞生物学行为检测发现，eIF4E稳定敲减的CNE2siEp细胞与未经感染处理的CNE2细胞、阴性对照CNE2siNC细胞相比，增殖活性下降，生长周期异常，迁徙活性明显降低，提示CNE2细胞内的eIF4E敲减明显影响了细胞的生物学行为，也说明eIF4E基因在鼻咽癌发生、发展中具有重要作用，为进一步研究其在基因表达调控中的作用和分子机制奠定了良好的基础。

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Construction of stable eIF4E knockdown nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line by lentivirus infection*

ZHAOYi,WANGYan,HUXin-rong△

(BasicMedicalSchool,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China)

Objective To establish a nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line with stable interference of eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) gene.Methods The interference sequences,targeting eIF4E gene sequence,were designed,coated and transfected into CNE2 cells,by using lentiviral vector infection system based on pGC-LV.The cells containing stable transformants were screened by the ability of resistance to puromycin.The expression of eIF4E was assayed by real-time polymerase chain reaction and Western Blot.The effects of eIF4E knockdown on proliferation and migration of CNE2 cells were tested.Results The lentivirus particles with short hairpin shRNA targeting eIF4E gene were constructed and screened successfully.CNE2 cells were transfected and anti-pure positive cell,which was named CNE2siEp cell,were obtained by antibiotic screening.Compared with negative control cells (CNE2siNC),the expression of eIF4E mRNA and protein in CNE2siEp cells were significantly decreased by 76.0% and 50.0% respectively.The proliferation and migration of CNE2siEp cells were also decreased by 85.0% and 59.0% respectively.Conclusion The stable eIF4E knockdown cell line (CNE2siEp) was constructed successfully,in which the expression and functions of eIF4E gene were inhibited significantly.

eukaryotic initiation factor 4E; knockdown; lentivirus infection; RNA interference

广东省卫生厅医学科研基金项目(B2013291)。

赵毅，男，讲师，博士研究生，主要从事肿瘤免疫学研究。△

，E-mail：chz020@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.005

A

1672-9455(2015)07-0888-03

2014-11-22

2014-12-28)