实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用*

陈 鑫，韩 霜，臧素纲，宣世海，汪晓莺，周玉贵△(.南通大学附属东台医院检验科,江苏东台 400;.南通大学医学院免疫教研室，江苏南通 600)



实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用*

陈 鑫1，韩 霜1，臧素纲1，宣世海1，汪晓莺2，周玉贵1△(1.南通大学附属东台医院检验科,江苏东台 224200;2.南通大学医学院免疫教研室，江苏南通 226001)

目的 建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375，并进行临床初步应用。方法 用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA，进行SYBR Green Ⅰ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线，绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果 该方法能定量检测血清miR-375表达水平，熔解曲线呈单峰，PCR扩增产物特异，在103～106copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997)，并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平，为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。

SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链反应； miR-375； 糖尿病

microRNAs(miRNAs)广泛存在于真核生物中，是一类参与基因转录后水平调控的非编码小分子单链RNA。成熟的miRNAs通过与其互补的靶mRNA碱基配对结合调控基因表达，不仅参与机体细胞生长、发育、分化、增殖、代谢、凋亡等一系列生理活动的调控，而且在多种疾病的病理过程中发挥重要作用[1-4]。病变组织miRNAs的表达水平显著异常于正常组织，呈现高度组织特异性，可以直接反映机体的病理状况。在胰腺和胰岛β细胞中表达的众多miRNAs中，miR-375不仅参与调控胰岛素的合成和分泌，还在胰岛的发育过程中发挥作用，提示与糖尿病的发病机制密切相关[5-7]。因而，对miR-375的研究具有非常重要的科研意义和应用前景。据此，本文建立了ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-375的方法，通过此种方法检测血清标本中miR-375的表达水平，初步探讨其对糖尿病诊断的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年6月至2013年6月南通大学附属东台医院经WHO(1999年)糖尿病诊断标准确诊的糖尿病患者118例，其中男59例，女59例，年龄26～88岁，病程数月到数年不等。另选择同期健康体检者106例，其中男52例，女54例，年龄28～84岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 样本采集 所有研究对象于清晨空腹采集静脉血3～5 mL。分离血清后分装至-80 ℃恒温冰箱保存。

1.3 主要试剂与仪器 Trizol溶解试剂、dNTP混合物、逆转录酶、逆转录缓冲液、Taq DNA聚合酶、内含SYBR Green Ⅰ荧光染料的PCR缓冲液、焦炭酸二乙酯(DEPC)、TAE缓冲液、溴化乙锭、离心管(南通碧云天技术研究所)，无水乙醇、氯仿、异丙醇(无锡展望化工试剂有限公司)，100 bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程有限公司)。Rotor Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(德国Qiagen公司)、HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、SMA1000微量紫外分光光度计(北京美林恒通公司)、DYY-III8A型稳压稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂)、DH-2000凝胶成像系统(北京华电公司)、BSC-1500ⅡA2X型生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司)。

1.4 引物设计和合成 根据miRBASE(http://www.mirbase.org/)数据库中Hsa-miR-375(UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA)序列，设计其特异性poly(A)加尾逆转录引物和PCR扩增引物。线虫C.elegans-miR-39模拟物、内参miR-15a及其引物均由德国Qiagen公司设计合成。

1.5 血清总RNA提取 取200 μL复溶的血清于离心管中，加入Trizol溶解试剂，充分混匀裂解；之后分别用氯仿、异丙醇及DEPC处理水配制的乙醇，并结合硅胶膜特异性吸附作用来分离和纯化RNA。RNA从离心管硅胶膜上洗脱溶于DEPC处理水中。通过测定计算RNA溶液260 nm和280 nm的紫外吸收值比值(A260/A280)确认RNA浓度和纯度。

1.6 逆转录反应 反应体系体积为20 μL，包括总RNA样本、dNTP混合物、逆转录酶、逆转录缓冲液、DEPC处理水。逆转录反应参数：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。逆转录反应获得的cDNA于-80 ℃保存。

1.7 实时荧光定量PCR 反应体系体积为20 μL，包括miRNA逆转录产物cDNA、dNTP混合物、miR-375上游特异引物、下游通用引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(内含SYBR Green Ⅰ荧光染料)、DEPC处理水。PCR循环参数：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。以同样的反应体系和Hsa-miR-15a特异性引物进行内参Hsa-miR-15a荧光定量。以DEPC处理水代替逆转录产物作为阴性对照。

1.8 标准曲线的制作 将人工合成的C.elegans-miR-39的miRNA模拟物以DEPC处理水稀释8个数量级，即101、102、103、104、105、106、107及108copy/μL，分别取每一数量级稀释液2 μL与待测标本同时进行逆转录及PCR扩增检测，每个反应设置3个复孔。扩增后根据扩增曲线设定统一阈值，然后根据标准品浓度及每个浓度对应的循环阈值(Ct)平均值绘制标准曲线。根据此标准曲线及待测样本Ct值计算出该血清标本miR-375的绝对浓度，为绝对定量法。

1.9 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 配制2%的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭(EB)溶液至终浓度0.5 μg/mL，80 V恒压电泳40 min，待溴酚蓝到2/3位置处停止电泳，紫外灯下观察产物的有无及大小。

2 结 果

2.1 血清总RNA抽提及纯度检测结果 经测量计算，所有标本提取RNA溶液的A260/A280比值(1.916±0.089)均在1.8～2.1内，由此表明RNA纯度较好，可用于后续试验。

2.2 熔解曲线及PCR扩增产物电泳验证 见图1。由图1可见，熔解曲线呈单峰，未见杂峰信号，熔解温度约为77 ℃。表明逆转录PCR参数选择适当，产物特异性较好。poly(A)聚合酶加尾法逆转录PCR获得的PCR扩增产物大小为85～87 bp。PCR扩增产物经2%琼脂糖电泳，可见明亮、清晰的电泳条带，与理想大小一致，见图2。

图1 实时荧光定量PCR熔解曲线

图2 逆转录PCR扩增产物电泳图

2.3 荧光定量PCR的检测重复性试验 任取1份糖尿病患者血清标本的RNA抽提溶液，在1次荧光定量PCR中设置10个平行孔进行检测，计算批内变异系数(CV)。结果显示，miR-375的拷贝数为(2.77±0.06)×103copy/μL，批内CV为2.16%。对同1份标本连续进行10次荧光定量PCR检测，计算批间CV。结果显示，miR-375的拷贝数为(2.75±0.14)×103copy/μL，批间CV为5.13%。

2.4 检测miR-375时标准品的扩增曲线及标准曲线 见图3。由图3可见，检测标准品C.elegans-miR-39模拟物的扩增曲线呈S型。在103～106copy/μL范围内Ct值和标准品浓度呈良好线性关系，r2=0.997，制作成标准曲线见图4。

图3 103～106 copy/μL梯度标准品的扩增曲线

2.5 miR-375在糖尿病患者及健康体检者血清中检测结果比较 118例糖尿病患者和106例健康体检者血清标本均可见扩增曲线，但表达程度不同，见图5。由表1可见，糖尿病患者和健康体检者血清中miR-375表达水平分别为(3.40±2.37)×103copy/μL和(1.11±0.67)×103copy/μL，糖尿病患者血清miR-375的表达水平高于健康体检者。经Mann-whitneyU检验进行组间比较，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 检测标准曲线

表1 两组血清miR-375表达情况

3 讨 论

近年来，miRNAs在机体生理、病理过程中的重要调控作用受到广泛关注，逐渐成为医学界的研究热点之一。miR-375是胰岛组织特异性miRNAs。研究发现，胰岛中高表达的miR-375可以抑制胰岛β细胞合成和分泌，同时miR-375还参与胰岛发育过程的调控[5-7]。这就为糖尿病基因诊断的研究提供了新的切入点。

miRNAs的检测技术不仅包括传统的表达文库克隆、Northern blot和荧光定量PCR，还包括新近发展起来的基因芯片技术、高通量测序技术等。实时荧光定量PCR因其敏感、特异、快速，已逐渐成为最常用且有效的定量检测方法[8]。目前，miRNAs检测的逆转录实时荧光定量PCR主要是基于茎环的RT-PCR和基于poly(A)加尾的RT-PCR[9-10]。这两种方法均可采用Taqman探针或SYBR荧光染料，前者特异性更高，但费用昂贵；后者通用性好，适合于推广开展。

本研究采用poly(A)聚合酶加尾逆转录和SYBR Green Ⅰ荧光染料标记技术，建立了一种实时荧光定量PCR检测血清中miR-375表达水平的方法。熔解曲线峰值单一，扩增曲线呈典型S型，显示基本没有引物二聚体和非特异性扩增产物的形成，结果可靠。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，也可见明亮清晰的电泳条带，并且与理论大小一致，由此证明扩增产物特异性较好。以人工合成的C.elegans-miR-39miRNA模拟物制作标准曲线，为绝对定量法，这与目前使用较多的相对定量法不同[11-12]。在103～106copy/μL范围内Ct值和标准品浓度呈良好线性关系(r2=0.997)，反映其能精确定量检测血清中miR-375的表达水平。重复性试验结果显示，批内CV为2.16%，批间CV为5.13%，由此表明该方法具有很好的稳定性。由此可见，本研究建立的检测方法可用于临床检测血清中miR-375的表达水平。通过分析定量检测数据发现，118例糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于106例健康体检者，差异有统计学意义(P<0.05)。这一结果不仅与基础研究的文献[5-7]报道相符合，而且与梁国威等[12]和Kong 等[13]采用其他方法对血清miR-375表达水平的检测结果也一致。

综上所述，本研究建立的ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测miR-375是一种快速、有效、灵敏度高、特异性强和稳定性好的方法，易于临床实验室推广应用，有助于对miR-375在糖尿病中的临床应用价值进行深入研究。

[1]Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[2]Pandey AK,Agarwal P,Kaur K,et al.MicroRNAs in diabetes:tiny players in big disease[J].Cell Physiol Biochem,2009,23(4/6):221-232.

[3]Calin GA,Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers[J].Nat Rev Cancer,2006,6(11):857-866.

[4]Zhang C.MicroRNAs:role in cardiovascular biology and disease[J].Clinl Sci(Lond),2008,114(12):699-706.

[5]Poy MN,Eliasson L,Krutzfeldt J,et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion[J].Nature,2004,432(714):226-230.

[6]El Ouaamari A,Baroukh N,Martens GA,et al.miR-375 targets 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and regulates glucose-induced biological responses in pancreatic beta-cells[J].Diabetes,2008,57(10):2708-2717.

[7]Joglekar MV,Joglekar VM,Hardikar AA.Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development[J].Gene Expr Patterns,2009,9(2):109-113.

[8]王勤熙，姚见儿，顾国浩.microRNAs的定量分析技术及其应用[J].临床检验杂志，2012，30(9)：650-652.

[9]Shi R,Chiang VL.Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR[J].Biotechniques,2005,39(4):519-525.

[10]Chen C,Ridzon DA,Broomer AJ,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005,33(20):e179.

[11]李晓娜，任海林，马德庆，等.膀胱癌患者血清miR-17-5p和miR-20a的表达及意义[J].临床检验杂志，2012，30(9)：645-646.

[12]梁国威，宋燕，邵冬华，等.初诊2型糖尿病患者血清中miR-29a和miR-375表达变化及其与糖、脂标志物相关性研究[J].中国实验诊断学，2013，17(3)：475-478.

[13]Kong L,Zhu J,Han W,et al.Significance of serum microRNAs in pre-diabetes and newly diagnosed type 2 diabetes:a clinical study[J].Acta Diabetol,2011,48(1):61-69.

Real-time fluorescence quantitative PCR for detecting expression of serum miR-375 and its clinical application*

CHENXin1,HANShuang1,ZANGSu-gang1,XUANShi-hai1,WANGXiao-ying2,ZHOUYu-gui1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedDontaiHospitalofNantongUniversity,Dongtai,Jiangsu224200,China;2.DepartmentofImmunology,MedicalCollegeofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To establish a method of SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)by poly(A)polymerase tailing for the determination of miR-375 in serum and to conduct the preliminary clinical application.Methods Total RNA was extracted from serum by Trizol reagent.miR-375 was reversely transcripted into cDNA by tailing poly(A)polymerase,and then the cDNA was amplified and detected by using SYBR Green I real-time FQ-PCR.To generate a standard curve of a dilution series of C.elegans-miR-39 mimic,and detect the expression level of miR-375 in serum quantitatively.Results The method could quantitatively detect the expression level of miR-375 in serum.The melting curve showed a single peak,the PCR amplification products were specific,a good linear relationship was showed in the range of 103-106copies/uL (r2=0.997),and the detection had good repeatability.The expression level of miR-375 in diabetic patients was significantly higher than that in healthy subjects,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion The established method of SYBR Green I FQ-PCR by poly(A)polymerase tailing can detect the expression level of serum miR-375 sensitively and specifically and lays a methodological foundation for further study on its clinical application.

SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR； miR-375； diabetes mellitus

江苏省盐城市医学科技发展计划项目(YK20130103)。

陈鑫，男，硕士，技师，主要从事分子生物学及免疫学研究。

△通讯作者，Email:yugui_z@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.012

A

1672-9455(2015)09-1208-03

2014-11-05

2015-01-19)