阿托伐他汀对高糖诱导的系膜细胞凋亡的影响*

朱 丹，胡 莹，赵 欣，马吉芳，郝建兵，任连生，崔 蕾(.哈尔滨医科大学附属第一医院肾内二病房 50070；.黑龙江省医院血液透析中心，哈尔滨 5000)



阿托伐他汀对高糖诱导的系膜细胞凋亡的影响*

朱 丹1，胡 莹1，赵 欣2，马吉芳1，郝建兵1，任连生1，崔 蕾1(1.哈尔滨医科大学附属第一医院肾内二病房 150070；2.黑龙江省医院血液透析中心，哈尔滨 150001)

目的 探讨不同浓度阿托伐他汀对大鼠系膜细胞凋亡的影响。方法 体外培养大鼠永生系膜细胞，分为5组：对照(C)组；高糖(30 mmol/L)(H)组；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)组；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)组；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 组。采用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡。采用caspase-3活性检测试剂盒检测系膜细胞caspase-3活性。结果 与C组相比，H组系膜细胞凋亡率明显增加，caspase-3活性明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与H组相比，高糖加不同浓度阿托伐他汀组细胞凋亡率明显降低，caspase-3活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖。结论 阿托伐他汀可以通过caspase途径抑制醛固酮诱导的大鼠系膜细胞凋亡。

阿托伐他汀； 高糖； 系膜细胞； 凋亡； caspase-3

糖尿病肾病(DN)的特点为早期出现微量蛋白尿，后期出现大量蛋白尿，严重DN可发展成尿毒症。由于DN的严重致残性，越来越多的学者开始致力于对其机制进行研究。Abboud[1]研究发现，大鼠肾脏系膜细胞的凋亡与蛋白尿的多少关系密切。因此本研究推断系膜细胞的凋亡参与了DN的发生和发展。Danesh和Kanwar[2]研究发现，他汀类药物除了具有降脂作用外，还具有其他方面的作用，如抗氧化应激作用，调节细胞周期，减少炎症等。本研究拟探讨他汀类药物对高糖诱导系膜细胞凋亡的影响，从而揭示DN发生的分子机制，深入探讨阿托法他汀保护肾脏的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 系膜细胞由上海长征医院梅长林教授赠送；阿托伐他汀为美国辉瑞公司生产的立普妥；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒由北京宝赛生物公司生产；caspase-3活性检测试剂盒由碧云天生物技术研究所生产。

1.2 分组 对照 (C) 组,高糖(30 mmol/L)(H)组,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)组,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)组,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 组。各组细胞加药后培养24 h。

1.3 检测方法

1.3.1 caspase-3活性检测 按碧云天caspase-3试剂盒说明书中步骤，迅速测定caspase-3的酶活性。

1.3.2 流式细胞术检测系膜细胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI双染法将样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。采用的判定标准为:左上象限PI(+)、AnnexinV(-)表示坏死细胞区;左下象限PI(-)、AnnexinV(-)表示活细胞区；右上象限PI(+)、Annexin V(+)表示凋亡晚期或死亡细胞区;右下象限PI(-)、AnnexinV(+)表示早期凋亡细胞区。

2 结 果

阿托伐他汀对caspase-3活性和系膜细胞凋亡率的影响 见表1。与C组相比，H组caspase-3活性明显增高，为(16.29±1.01)%，差异有统计学意义(P<0.05)，H+A1组为(12.37±1.02)%，H+A2组为(9.25±0.92)%，H+A3组为(6.26±0.45)%，均较H组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖。C组阿托伐他汀对系膜细胞凋亡率为(2.71±0.24)%,H组为(20.05±0.21)%，H+A1组为(16.45±0.45)%，H+A2组为(12.31±0.33)%，H+A3组为(7.25±0.73)%。高糖可以诱导系膜细胞凋亡，而阿托伐他汀可以抑制系膜细胞凋亡，且其作用呈浓度依赖。

表1 各组caspase-3活性和系膜细胞凋亡率比较

注：与C组相比，*P<0.05；与H组相比，#P<0.05；与H+A1组相比，△P<0.05；与H+A2组相比，▲P<0.05。

3 讨 论

细胞凋亡可能会引起系膜细胞减少，增加尿蛋白漏出，从而最终导致肾小球硬化[3];而肾小管萎缩、肾间质纤维化，可以由肾小管上皮细胞凋亡引起，造成尿蛋白加重，最终损害肾功能[4]。近些年，随着人们对肾脏细胞凋亡研究的不断深入，发现细胞凋亡与DN的发生和发展密切相关。

许多学者研究表明，他汀类药物可以减少尿蛋白排泄，延缓糖尿病患者肾小球滤过率下降，减少肾小球硬化速度，从而延缓DN的进展，起到肾脏保护作用[5]。

Zhou 等[6]研究发现，阿托伐他汀可以通过减少线粒体融合蛋白2的表达来抑制心肌缺血大鼠心肌细胞的凋亡。Nam 等[7]研究发现，瑞舒伐他汀可以通过smad依赖性通路及smad非依赖性通路减少环孢素肾病模型大鼠肾脏细胞的凋亡，抑制炎症，减轻肾脏纤维化。Ishibashi等[8]研究表明，普伐他汀可以通过减少晚期糖基化终末产物受体，从而抑制近端肾小管细胞凋亡。Copaja 等[9]研究发现，辛伐他汀可以通过Rho依赖机制诱导心肌成纤维细胞凋亡。Lavi等[10]研究发现，内皮祖细胞在高胆固醇猪的肾脏中可以凋亡，但辛伐他汀可以减少高胆固醇血症引起的细胞凋亡，从而减少肾脏损伤，起到肾脏保护作用。Cormack-Aboud等[11]研究发现，瑞舒伐他汀可以通过P21依赖性抗凋亡通路抑制足细胞凋亡，从而减少足细胞损伤，减少尿蛋白，保护肾脏。Lin 等[12]研究发现，辛伐他汀可以通过调节Wnt 信号通路抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡。Bussolati等[13]研究表明，他汀类药物可以减少氧化低密度脂蛋白诱导的细胞凋亡，也可以减少肾小球足细胞膜裂空蛋白丢失，其作用可能是通过Akt通路实现的。

本研究发现，高糖作用于肾小球系膜细胞引起凋亡的同时，可引起caspase-3活性增加，表明高糖是通过活化caspase引起系膜细胞凋亡的，而阿托伐他汀可以通过抑制caspase活化减少系膜细胞凋亡，且随着阿托伐他汀浓度增加，其抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡作用逐渐加强。

综上所述，本研究结果显示，高糖引起caspase-3活化，从而诱导大鼠系膜细胞凋亡，而高糖的上述作用可以被阿托伐他汀所抑制，且呈浓度依赖性。

[1]Abboud HE.Mesangial cell biology[J].Exp Cell Res,2012,318(9):979-985.

[2]Danesh FR,Kanwar YS.Modulatory effeets of HMG-CoA reduetase Inhibitors in diabetic microangiopathy[J].FASEB J，2004，18(7):805-815.

[3]Schiffer M，Bitzer M,Roberts IS，et al.Apoptosis in podocytes indued by TGF-beta and Smad7[J].J Clin Invest，2001，108(6):807-816.

[4]Sugiyama H，Kashihara N，Makino H,et al.Apoptosis in glomerular selerosis[J].Kidney Int，1996，49(1):103-111.

[5]Heart Protection Study Collaborative Group.MRC/BHF heart protection study of ch-olesterol lowering with simvastatin in 20,536 high-risk individuals:a randomized placebo-controlled trial [J].Lancet,2002，360(9326):7-22.

[6]Zhou W,Chen L,Chen M.Atorvastatin inhibits cardiomyocyte apoptosis via down-cegulation the expression mitofusin 2 after myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2014,30(4):388-390.

[7]Nam HK,Lee SJ,Kim MH,et al.Rosuvastatin attenuates inflammation,apoptosis and fibrosis in a rat model of Cyclosporine-Induced nephropathy[J].Am J Nephrol,2013,37(1):7-15.

[8]Ishibashi Y,Yamagishi S,Matsui T,et al.Pravastatin inhibits advanced glycation end products (AGEs)-induced proximal tubular cell apoptosis and injury by reducing receptor for AGEs (RAGE) level[J].Metabolism,2012,61(8):1067-1072.

[9]Copaja M,Venegas D,Aránguiz P,et al.Simvastatin Induces Apoptosis by a Rho-dependent mechanism in cultured cardiac fibroblasts and myofibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,255(1):57-64.

[10]Lavi R,Zhu XY,Chade AR,et al.Simvastatin decreases endothelial progenitor cell apoptosis in the kidney of hypertensive hypercholesterolemic pigs[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(5):976-983.

[11]Cormack-Aboud FC,Brinkkoetter PT,Pippin JW,et al.Rosuvastatin protects against podocyte apoptosis in vitro[J].Nephrol Dial Transplant,2009,24(2):404-412.

[12]Lin CL,Cheng H,Tung CW,et al.Simvastatin reverses high glucose-induced apoptosis of mesangial cells via modulation of Wnt signaling pathway[J].Am J Nephrol,2008,28(2):290-297.

[13]Bussolati B,Deregibus MC,Fonsato V,et al.Statins prevent oxidized LDL-induced injury of glomerular podocytes by activating the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-signaling pathway[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(7):1936-1947.

Effect of atorvastatin on apoptosis of hyperglycemia induced mesangial cells in rat*

ZHUDan1,HUYing1,ZHAOXin2,MAJi-fang1,HAOJian-bing1,RENLian-sheng1,CUILei1

(1.SecondDepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospitalofHaerbinMedicalUniversity,Haerbin,Heilongjiang,150070,China;2.HemodialysisCenterCenter,HeilongjiangProvincialHospital,Haerbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To investigate the influence of different concentrations of atorvastatin on apoptosis of rat mesangial cells.Methods Rat immortal mesangial cells were cultured in vitro and divided into 5 groups:control(C) group,hyperglycemia (30 mmol/L,H)group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-7mmol/L)(H+A1) group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-6mmol/L)(H+A2)group and hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-5mmol/L)(H+A3)group.Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining,and the caspase-3 activity was assayed by the caspase-3 activity kit.Results Compared with the group C,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the group H were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Compared with the group H,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the H+A1,2,3 groups were significantly decreased,the differences were statistically significant(P<0.05),moreover which showing the concentration dependence.Conclusion Atorvastatin may inhibit aldosterone induced mesangial cells apoptosis via caspase pathway.

atorvastatin; high glucose; mesangial cells; apoptosis; caspase-3

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521293)。

朱丹，女，博士，副主任医师，主要从事糖尿病肾病肾纤维化研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.007

A

1672-9455(2015)09-1196-02

2014-11-11

2015-01-25)