人乳头瘤病毒基因分型联合液基薄层细胞学检测在宫颈疾病检查中的意义

汤雯剑，马艳侠(.陕西省延长油田股份有限公司青化砭采油厂医务所，陕西延安 76003；2.陕西中医学院附属医院，陕西咸阳 72000)



人乳头瘤病毒基因分型联合液基薄层细胞学检测在宫颈疾病检查中的意义

汤雯剑1，马艳侠2△(1.陕西省延长油田股份有限公司青化砭采油厂医务所，陕西延安 716003；2.陕西中医学院附属医院，陕西咸阳 712000)

目的 探讨该地区女性宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染状况及HPV分型联合液基薄层细胞学(TCT)检测的临床意义。方法 对2012年12月至2014年1月该院就诊的2 816例成年女性，采集宫颈脱落细胞，应用HPV-PCR反向斑点杂交技术检测其HPV基因亚型，统计不同年龄段HPV感染情况，其中231例临床疑似宫颈病变者同时行TCT检查及病理活检，以病理诊断为金标准进行确诊。结果 2 816例检出阳性598例，感染率21.24%，高危亚型最多的为16型(5.82%)，低危亚型最多为6型(9.55%)；不同年龄段之间HPV感染率不同，差异有统计学意义(χ2=17.21，P<0.01)，>60岁者感染率最高，30～39岁感染率最低；感染类型以单一感染为主，多重感染比例最低；231例患者中宫颈疾病89例，HPV检出率高于TCT，差异有统计学意义(χ2=16.06，P<0.01)，两者联合检出率高于单独TCT或HPV检测，差异均有统计学意义(χ2=22.04，P<0.01；χ2=4.17，P<0.05)。结论 HPV基因分型联合TCT检测对宫颈疾病检测与宫颈癌筛查有重要临床价值。

人乳头瘤病毒； 基因分型； 液基薄层细胞学

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，是全球排名第3位的女性常见癌，严重威胁女性健康[1]。有研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的重要因素[2-3]。HPV基因分型检测是宫颈癌筛查中重复性较好的技术，液基薄层细胞学检查(TCT)也是筛查宫颈癌的常用有效方法，但两者的成本及效果各异[4-5]。本研究按不同年龄段统计HPV感染情况，并以病理活检为金标准分析与TCT联合应用的检测效果，探讨HPV与TCT联合检测在宫颈疾病检测与宫颈癌筛查中的临床价值。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年12月至2014年1月在陕西中医学院附属医院就诊及体检的成年女性2 816例，年龄20～80岁，平均年龄(39.86±9.58)岁。20～29岁510例，30～39岁734例，40～49岁780例，50～59岁487例，>60岁305例。对231例临床疑似宫颈病变患者同时行TCT检测和病理活检，患者均非孕期，且排除子宫切除、盆腔放疗等病史。所有患者均知情同意及自愿。

1.2 检测方法

1.2.1 HPV-DNA基因分型检测 采用专用宫颈刷无菌条件采集脱落细胞，置于专用样本收集管并及时送检。HPV-DNA的提取、扩增、杂交、洗膜及显色等过程严格参照试剂说明书和仪器标准操作规程进行。检测19 种亚型，其中16种高危亚型(HR-HPV)依次为16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304型，3 种低危亚型(LR-HPV)分别是6、11、43型。每批实验均同时设阴性对照和HPV16阳性对照，实验结果有效条件为结果在控且“Globin”位点与“显色探针”均显色。

1.2.2 TCT检测 选取非月经期且近3 d无阴道冲洗或用药，使用专用取样刷于宫颈管鳞柱交界部的可疑病变区域采集标本，将标本置于专门的液基细胞保存液，及时行TCT检查，巴氏染色后结果判读参照国际癌症协会推荐的TBS(The Bethesda System)分级诊断标准，对细胞改变的诊断包括：良性细胞改变(NILM)、不明确意义的非典型鳞状上皮细胞(AS-CUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)、腺癌。细胞学异常是AS-CUS及以上病变者。

1.2.3 宫颈病理活检 对宫颈可疑部位进行多点取材，如无异常则取3、6、9、12点处，将标本用甲醛固定后及时送检，所有阅片诊断结果均由该院两位高年资病理诊断医师共同确定。活检异常结果分为轻度子宫颈上皮内瘤变(CINⅠ)、中度子宫颈上皮内瘤变(CINⅡ)、重度子宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)、宫颈癌。其中CINⅠ即TCT标准中的LSIL,CINⅡ与CINⅢ即TCT标准中的HSIL。

1.3 仪器与试剂 Biometra系列定性PCR基因扩增仪(德国)，DA8000全自动分子杂交仪(广州达安)，K30B型干式恒温器(杭州奥盛)，Bioaer AG0410062型生物安全柜(广州达安)，TG16-WS型台式离心机(长沙湘仪)。HPV基因分型检测试剂盒(广州达安)，MCT-Ⅱ型液基薄层细胞制片分析系统(陕西高源)。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验或F检验。以α=0.05为检验标准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HPV感染率及感染亚型 2 816例共检出HPV阳性598 例，感染率21.24%。高危型感染亚型前3位是16型(5.82%)、52型(2.95%)、58型(2.27%)，其余按感染率由高到低依次为53(1.56%)、51(1.24%)、39(1.14%)、CP8304(1.07%)，33(0.92%)、66(0.82%)、31(0.78%)、18(0.64%)、68(0.64%)、56(0.46%)、59(0.39%)、35(0.32%)、45(0.25%)。低危型感染率依次为6型(9.55%)、43型(2.34%)、11型(1.35%)。

2.2 不同年龄段HPV感染率及感染类型 不同年龄段之间HPV感染率差异有统计学意义(χ2=17.21，P<0.01)。>60岁感染率最高(32.18%)，30～39岁的感染率最低(19.24%)，其余各组依次为20～29岁(26.09%)、50～59岁(23.54%)、40～49岁(19.51%)。598例阳性患者中，单一感染475例(占79.43%)，双重感染共97例(占16.22%)，多重感染共26例(占4.35%)。见图1。

图1 不同年龄段HPV感染率及感染类型

2.3 HPV与TCT检测结果 231例临床疑似宫颈病变者同时进行HPV、TCT及病理活检，病理活检诊断异常者89例，以病理活检诊断结果为金标准进行分组，其中HPV检测阳性者59例，TCT检测阳性者41例，HPV阳性率(66.29%)高于TCT(46.07%)，差异有统计学意义(χ2=16.06，P<0.01)，两者联合检测阳性者65例，阳性率高于单独行TCT检测，差异有统计学意义(χ2=22.04，P<0.01)，也高于单独行HPV检测，差异也有统计学意义(χ2=4.17，P<0.05)。见表1。

表1 宫颈病变患者HPV与TCT检测结果比较[n(%)]

3 讨 论

宫颈癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，研究表明其发病率近年来仍在不断上升[6]。HPV是一种双链DNA病毒，内含8 000个碱基对，相对分子质量约为5×103，而其持续感染是宫颈癌重要的致病因素之一，HPV16、18亚型(尤其是16型)是导致宫颈癌的主要基因亚型，其致癌机制是通过致癌蛋白E6和E7与抑癌基因p53和pRb相结合，然后E6和E7分别抑制与灭活p53和pRb蛋白，造成宿主细胞周期紊乱和发生凋亡，并破坏正常增殖与凋亡的平衡性，使其增殖过度进而产生恶性转化[7]。依据致癌可能性分为低危型和高危型，低危型(包括6、11、42等)主要引发良性病变(如尖锐湿疣等)和CINⅠ，高危型(包括16、18、31等)主要导致CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌，高危型中53、CP8304型是中国人特有的[8]。高危型HPV反复持续性感染可导致宫颈发生由上皮内瘤样病变到原位癌，最终形成浸润癌，因此对其亚型的检测在宫颈病变预防和评估治疗中都有重要的临床价值，早期发现可及时干预治疗，避免病情进一步恶化，从而降低宫颈癌的发病率。PCR反向斑点杂交技术具有简便快速、敏感性高、特异性强等优势，广泛用于HPV基因分型检测。TCT检查是采用薄层液基细胞学检测系统检测宫颈细胞并进行细胞学分类诊断，是目前国际上较先进的一种宫颈癌细胞学检查技术，比传统的宫颈刮片后行巴氏染色检查的检出率高，可为宫颈癌早期诊断和治疗提供明确的病理学依据[5]。

本研究结果表明，该地区高危感染亚型中检出率前3位依次是16、52、58型，与其他地域的报道有差异[9-10]。提示HPV亚型的分布具有一定的地域性，不同地区亚型感染模式各异，另外也可能是由于采用的检测技术不同，从而检测的型别范围有所不同。本组结果显示，不同年龄段之间HPV感染率差异有统计学意义(P<0.01)，>60岁感染率最高，可能与本组研究对象分布在该年龄段例数较少或疾病发展等相关，20～29岁阳性率也较高，30～49岁感染例数最多，与研究对象分布在该年龄段例数较多有关，还可能由于该年龄段女性处于性活跃期和生育高峰期等。在感染类型中，单一基因型别感染率最高，多重基因型别感染率最低。有学者研究报道，HPV多重感染率在宫颈癌患者中反而比健康者低，这是否由于HPV致病性发生改变所致，有待深入研究探讨[11]。

本研究结果提示TCT在CINⅠ时检出率较低，可能和此方法的敏感性较低、诊断水平差异、诊断标准掌握不严格、制片质量等原因有关，会出现一定比例的假阴性或假阳性，由此也说明TCT诊断不可代替组织病理学诊断，尤其在宫颈病变初期，其诊断符合率较低，随着宫颈病变的程度增高，特别是到宫颈癌阶段，TCT诊断率明显增加，提示对于TCT诊断为高度病变者更需引起重视。本研究结果显示，HPV检测有着较高的检出率，其感染比细胞学异常出现更早，并且与联合检测效果更接近，对于宫颈癌及宫颈疾病病变者能起到有效的预警作用，其原因可能由于宫颈鳞状上皮病变与HPV感染更密切，因此对于宫颈疾病患者进行HPV亚型检测及流行病学分析研究，对宫颈癌早期预防具有重大意义[12]。本研究还发现TCT与HPV检测联合，检测率有较大提高，提示在宫颈疾病筛检，特别是在CINⅠ级的宫颈早期病变时应联合检测HPV分型和TCT，可更有效防止假阴性结果，降低漏诊率，从而显著提高宫颈病变的检出率与准确性[13-14]。

此外，进行HPV与TCT检测时，若同时联合检测宫颈癌相关的血清肿瘤标志物(如鳞状细胞癌抗原、细胞角蛋白19、人附睾蛋白4等)是否能更进一步提高宫颈病变检出率，还有待后续进一步研究分析。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.052

A

1672-9455(2015)11-1618-02

2014-12-15

2015-02-20)

△通讯作者，E-mail:zhmazhch81763@163.com。