科玛嘉显色培养和API20C AUX鉴定酵母样真菌的临床价值

2015-03-15赵琳琳王江元吉林大学第一医院二部检验科长春130031

检验医学与临床 2015年11期

赵琳琳，王江元，艾清(吉林大学第一医院二部检验科，长春 130031)

赵琳琳，王江元，艾清△(吉林大学第一医院二部检验科，长春 130031)

目的探讨科玛嘉显色培养和API20C AUX(简称API20C)鉴定酵母样真菌的对比研究。方法收集该院微生物室2012～2013年无菌体液标本分离出的酵母样真菌121株，对所有菌株进行科玛嘉显色培养鉴定和API20C鉴定。通过基因序列分析法将真菌准确鉴定到种。结果显色培养基除13株无法鉴定、8株鉴定错误外其余菌株均鉴定正确，正确率为92.59% (100/108)。API20C除5株鉴定错误、4株无鉴定结果外其余菌株均鉴定正确，正确率为92.56%(112/121)；其中对显色培养能鉴定菌株的正确率为95.37%(103/108)，对显色培养无法鉴定菌株的正确率为69.23%(9/13)。结论科玛嘉显色培养和API20C方法对大多数临床分离菌株能够准确鉴定到种，API20C对少见真菌和显色不典型菌种的鉴定有待进一步验证。

酵母菌； API20C AUX；显色培养；序列分析； DNA

近年来，由于广谱抗菌药物的不规范使用、免疫抑制剂的广泛应用，真菌引起的感染逐年上升[1-2]。有报道显示白色酵母样真菌的药物敏感性高于非白色酵母样真菌，不同菌种的酵母样真菌对抗真菌药物的敏感性和耐药性不同，所以真菌的准确鉴定对指导临床用药尤为重要[3-5]。临床工作中常用的真菌鉴定方法有科玛嘉显色培养法、API20C AUX(简称API20C)等生化反应鉴定卡，本研究以分子生物学方法为“金标准”，对科玛嘉显色培养和API20C鉴定酵母样真菌的能力进行评估[6-7]。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集该院微生物室2012年1月至2013年12月无菌体液和血液标本中分离出的酵母样真菌共121株(已剔除同一患者同一部位或不同部位标本反复检出的相同菌株)，干滤纸片法-80 ℃保存。

1.2 质控菌株选取3株标准菌株作为质控菌株：白色假丝酵母菌(ATCC90028)、光滑球拟假丝酵母菌(ATCC90030)、热带假丝酵母菌(ATCC1463)，标准菌株均购自卫生部临床检验中心。

1.3 仪器与试剂 LD5-10B低温离心机(美国赛默飞世尔科技)，T-100 PCR仪(美国Bio-rad公司)，BC-J80S隔水式恒温培养箱(上海博讯医疗设备厂)。PCR扩增试剂盒(上海生工)，科玛嘉显色培养基(法国梅里埃)，API20C AUX鉴定卡(法国梅里埃)。

1.4 真菌显色培养鉴定所有菌株接种于沙氏培养基后36 ℃培养24 h，重复1次上述操作，使真菌充分复苏并分离出单个菌落。挑取沙氏培养基上的单个菌落接种于科玛嘉显色培养基，36 ℃培养72 h后判定结果(每24 h观察1次显色情况)：绿色、翠绿色菌落为白色假丝酵母菌；蓝灰色、铁灰色菌落为热带假丝酵母菌；粉红色模糊有微毛菌落为克柔假丝酵母菌；紫红色光滑菌落为光滑球拟假丝酵母菌；显色不典型和白色菌落为无法鉴定的其他假丝酵母菌。

1.5 真菌API20C鉴定配制所有菌株的菌悬液(2.0 Mac)，取100 μL菌悬液至API C Medium培养基，混均后加入API20C真菌鉴定试剂条，29 ℃培养48～72 h后与阴性孔对照，阅读生化谱。生化谱输入API20C 3.0系统进行结果判读：鉴定百分率≥80%且T≥0为“可接受的鉴定”，鉴定百分率<80%为“无鉴定结果”。

1.6 分子生物学鉴定采用直接煮沸法提取真菌DNA，选取真菌通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增[6-7]。PCR体系为50 μL：PCR Master 25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，无菌双蒸水至50 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；最后72 ℃延伸8 min。DNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工测序，测序结果提交GenBank数据库进行序列分析，从而将所有菌株准确鉴定到种。

2 结果

2.1 质量控制 3株标准菌株白色假丝酵母菌(ATCC 90028)、光滑球拟假丝酵母菌(ATCC 90030)、热带假丝酵母菌(ATCC 1463)通过科玛嘉显色培养、API20C、基因序列分析法均能准确鉴定至种。见图1。

2.2 显色培养鉴定结果显色培养基仅能鉴定4种常见的酵母样真菌，有13株无法鉴定，鉴定率为89.26%(108/121)，与国内有关文献报道一致[8]。其中108株菌株的鉴定结果中有8株与基因序列分析结果不符，正确率为92.59%(100/108)。

2.3 API20C鉴定结果 13株显色无法鉴定菌株经API20C鉴定，除1株近平滑假丝酵母菌和2株葡萄牙假丝酵母菌鉴定错误、1株白色假丝酵母菌无鉴定结果外，其余菌株均鉴定正确，正确率为69.23%(9/13)。108株显色鉴定至种菌株经API20C鉴定，除1株白色假丝酵母菌和1株热带假丝酵母菌鉴定错误、1株季也蒙假丝酵母菌和2株热带假丝酵母菌无鉴定结果外，其余菌株均鉴定正确，正确率为95.37%(103/108)。API20C的总正确率为92.56%(112/121)，接近国内相关文献报道[9]。见表1。

注：1表示白色假丝酵母菌(ATCC 90028)；2表示热带假丝酵母菌(ATCC 1463)；3表示光滑球拟假丝酵母菌(ATCC 90030)。

图1 标准菌株显色结果

注：括号内为菌株数。

3 讨论

本研究以分子生物学方法鉴定结果为金标准，对科玛嘉显色培养和API20C的鉴定能力进行评估。从菌种库中选取的少见菌种的菌株比例常较临床分离菌株高，这与临床实际情况不符。本研究菌株收集2012年1月至2013年12月临床无菌体液和血液标本中分离出的不同患者的全部酵母样真菌，在菌种构成上与临床符合，因此得出的结果更能反映显色培养和API20C在临床应用中的价值。

显色培养基鉴定结果显示，8株菌株显色培养错误鉴定，显色培养可鉴定菌种内的2株常见菌株无法鉴定，可能原因：(1)个人颜色辨别能力不同。如蓝灰色、蓝紫色、紫红色辨别的差异。(2)常见菌株在科玛嘉显色培养基上显色不典型。如本组显白色的白色假丝酵母菌和显橘红色的光滑球拟假丝酵母菌，这2株菌株在显色培养基可鉴定至菌种，但显色培养基均无法鉴定。(3)少见菌株显出与常见菌株相似的颜色。如1株葡萄假丝酵母菌和1株季也蒙假丝酵母菌均显示紫红色，易错误鉴定为光滑球拟假丝酵母菌；1株阿萨希丝孢酵母显出绿色，易错误鉴定为白色假丝酵母菌。API20C鉴定结果表明，有9株菌株鉴定错误或无鉴定结果，其中包括6株常见菌株(2株白色假丝酵母菌、3株热带假丝酵母菌和1株近平滑假丝酵母菌)，原因可能为：(1)广谱抗菌药物、免疫抑制剂的应用使菌株的生化反应不再典型。(2)菌株的生长状态不同，生化反应结果不同。科玛嘉显色培养基鉴定正确率为92.59%，API20C鉴定酵母样真菌的总正确率为92.56%，说明科玛嘉显色培养基和API20C能够将大多数临床分离菌株准确鉴定到种。但是临床工作中对显色培养可以鉴定的菌株不再进行API20C的鉴定，所以应该更加注重API20C对显色无法鉴定菌株的鉴定能力的评估。本研究中显色无法鉴定的13株菌株经API20C鉴定，3株鉴定错误，1株无鉴定结果，鉴定正确率仅为69.23%(9/13)，低于API20C的总鉴定正确率。但本研究中显色无法鉴定菌株标本量少，所以API20C对临床分离的显色无法鉴定的少见真菌和显色不典型菌株的鉴定能力有待进一步验证。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.044

1672-9455(2015)11-1602-02

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