SMAD家族成员4 shRNA干扰慢病毒构建与分析

李忱炜(重庆市渝北区人民医院检验科 401120)



SMAD家族成员4 shRNA干扰慢病毒构建与分析

李忱炜(重庆市渝北区人民医院检验科 401120)

目的 制备shRNA干扰人SMAD家族成员4(SMAD4)的慢病毒载体(shRNA-SMAD4)，为深入研究BMPs/SMAD信号通路奠定基础。方法 利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计，根据小干扰RNA的设计原则，选取3对针对SMAD4特异性干扰引物而合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-SMAD4质粒。用PCR及测序对其鉴定，然后与慢病毒包装质粒混匀，由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装，产生慢病毒shRNA-SMAD4，并收集上清液感染乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过RT-PCR及Western Blot鉴定重组慢病毒干扰效果。结果 (1)shRNA干扰SMAD4特异性引物的获得。(2) pSIH1-H1-shRNA SMAD4质粒经PCR验证和测序后，证实构建成功。(3) shRNA-SMAD4在HEK293T中重组成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231。(4)shRNA-SMAD4感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后SMAD4的表达降低。结论 成功构建shRNA-SMAD4慢病毒载体，并能有效抑制SMAD4表达。

慢病毒载体； 短发卡RNA； SMAD家族成员4

乳腺癌是一类易发生转移的肿瘤，近年来研究发现骨形态发生蛋白(BMPs)作为转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,在乳腺癌的生长、侵袭、迁移中起着重要作用[1]。本组前期研究和文献报道均表明，BMPs/SMAD参与乳腺癌MDA-MB-231生长、侵袭、迁移过程,而且BMPs/SMAD在MDA-MB-231中处于激活状态[1]。骨形态发生蛋白7(BMP7)和骨形态发生蛋白9(BMP9)作为乳腺癌的负性因子能够抑制MDA-MB-231生长、侵袭、迁移以及转移过程，有研究还发现BMP9能抑制MDA-MB-231的骨转移过程[2]。但MDA-MB-231中内源性BMP7和BMP9未见其表达或表达明显降低。MDA-MB-231作为一株恶性程度较高的三阴性乳腺癌细胞株，抑制其处于激活状态的BMPs/SMAD通路会对MDA-MB-231的生长、侵袭、迁移中起各种调节作用。SMAD家族成员4(SMAD4)作为BMPs/SMAD这一信号通路的中间环节，对信号通路调控起着重要作用[3-4]。如下调SMAD4表达，抑制BMP/SMAD参与MDA-MB-231的生长、侵袭、迁移过程，MDA-MB-231的恶性程度是否明显降低。本研究通过美国SBI公司第4代慢病毒包装系统，构建SMAD4慢病毒表达载体，为乳腺癌转移分子机制奠定基础，从而有效治疗乳腺癌。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 pSIH1-H1质粒和慢病毒包装质粒pPACKH1购自美国SBI公司。大肠埃希菌STBL-3菌种以及人胚肾HEK293T细胞，由重庆医科大学临床检验诊断学实验室提供。

1.2 主要试剂 Trizol，脂质体2000转染试剂盒(Life公司)；DMEM 高糖培养基，胎牛血清(Hyclone公司)；干扰引物(Invitrogen上海生物技术有限公司合成)；限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，T4连接酶(New England Biolab公司)；DNA纯化试剂盒(Omega公司)。

1.3 方法

1.3.1 SMAD4干扰引物设计与合成 将人SMAD4的mRNA基因(GenBank序列号为NM_005359.5)CDS区输入至Life RNA在线设计干扰网页中，按照小干扰RNA的设计原则，选取3对干扰引物作为实验组，同时设计1对完全随机引物作为阴性干扰对照组，将选取的干扰引物按照shRNA的构成原则，中间以TCAAGAG为颈环结构，并在2端添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。合成的DNA分别命名为shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive。

1.3.2 干扰质粒PCR验证引物设计 SMAD4干扰质粒PCR验证上游引物：5′-AAT GTC TTT GGA TTT GGG AAT CTT AT-3′;下游引物：5′-TGG TCT AAC CAG AGA GAC CCA GTA-3′，未插入干扰片段质粒扩增长度105 bp，插入干扰片段后质粒扩增长度为161 bp。SMAD4 PCR上游引物：5′-CTG GAC TGG AAG TAG GAC-3′；下游引物：5′-AAG TAA GCA ATG GAA CAC-3′，扩增长度186 bp。GAPDH上游引物：5′-CAG CGA CAC CCA CTC CTC-3′；下游引物：5′-TGA GGT CCA CCA CCC TGT-3′，扩增长度120 bp。

1．3.3 2种基因与载体pSIH1-H1的连接 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pSIH1-H1质粒，酶切产物经纯化试剂盒纯化，DNA连接试剂盒连接，shRNA-SMAD4基因采用连接产物命名为pSIH1-H1-shRNA-SMAD4，shRNA-Negtive基因使用连接产物命名为pSIH1-H1-shRNA-Negtive。

1.3.4 pSIH1-H1-shRNA-SMAD4和pSIH1-H1-shRNA-Negtive质粒的鉴定 连接产物经Cacl2化转入STBL-3菌株，接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜后挑取单个菌落，加入至3 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃，220 r/min摇床培养12 h将菌液扩大培养后提取质粒，5 μL菌落PCR鉴定，10 μL送南京金斯瑞有限公司测序。

1.3.5 shRNA干扰慢病毒的包装和病毒上清液收集 将构建好并测序正确的干扰质粒和慢病毒包装质粒按慢病毒包装质粒试剂盒混匀，并与Lipofectamine 2000转染入HEK293T细胞，37 ℃、5% CO2的饱和湿度细胞培养箱培养，观察荧光表达量，至48 h后收集细胞培养液，离心后获取上清液至无菌EP管备用。

1.3.6 重组干扰慢病毒在MDA-MB-231的感染以及干扰效果测定 将包含病毒颗粒的培养液加入至MDA-MB-231，24 h观察慢病毒感染荧光表达情况，并提取细胞总RNA，干扰慢病毒48 h后提取细胞总蛋白，观察mRNA和蛋白水平干扰效果。

2 结 果

2.1 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive引物序列 根据Ambion在线设计干扰引物网页，点击干扰片段设计，遵循干扰RNA设计原则,选取其中3对作为SMAD4干扰靶序列，设计合成shRNA引物。见表1。

表1 3对shRNA干扰引物和阴性对照引物序列

2.2 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive的鉴定 构建完成的质粒经PCR初步鉴定后，扩增出相应条带，认为质粒初步构建成功，立即送公司测序，经测序后进行序列比对，确定质粒是否构建成功。经PCR初步验证后在105 bp有条带，认为连接成功，送公司测序并将测序结果进行比对后，证明质粒完全构建成功。见图1、2。

图1 shRNA-SMAD4-1PCR检测结果图

图2 shRNA-SMAD4-1的测序比对图

2.3 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive慢病毒的包装和病毒收集 shRNA-SMAD4、shRNA-Negtive和慢病毒载体混匀后，经脂质体转染入人HEK293T细胞，48 h后收集细胞上清培养液，离心去除细胞碎片后，收集病毒液(以shRNA-SMAD4-2和shRNA-Negtive举例说明)。加入直径6 cm铺有细胞密度60%～80%的MDA-MB-231培养皿中，24 h观察荧光表达，表达量约为60%，见图3。

图3 shRNA-Negtive荧光表达图(×100)

2.4 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive在mRNA和蛋白水平的表达 慢病毒感染MDA-MB-231后，24 h提取细胞总RNA,48 h提取细胞总蛋白。通过聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western-blot)检测SMAD4干扰慢病毒的干扰效果。慢病毒感染24 h后，感染率均值约60%。RT-PCR显示shRNA-SMAD4-1、shRNA-SMAD4-2和shRNA-SMAD4-3组细胞SMAD4 mRNA 的表达较shRNA-Negtive组均有所降低，分别降低52.17%、46.33%、40.18%。表明shRNA-SMAD4-3的干扰效果最好，且得到Western-blot进一步证实。本组实验结果提示，干扰慢病毒载体构建成功。见图4。

注：1：shRNA-Negtive；2：shRNA-SMAD4-1；3：shRNA-SMAD4-2；4：shRNA-SMAD4-3。

3 讨 论

肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与的复杂生物学过程，目前其机制尚未完全明了。乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤的第1位。目前有文献报道BMPs/SMAD在乳腺癌的生物学过程中起着重要作用，Katsuno等[5]研究发现骨形态发生蛋白2(BMP2)通过BMPs/SMAD通路促进MDA-MB-231侵袭迁移。BMP2在体内外能够促进雌激素受体阳性的MCF7侵袭迁移，过表达BMP2的MCF-7细胞复制乳腺癌异种移植瘤，裸鼠动物模型中发现有明显新生血管形成[6]。Liu等[7]结合临床标本和实验数据提出SMAD4可作为乳腺癌的诊断指标。Xue等[8]研究表明SMAD4作为一关键分子参与肿瘤转移过程，Flanders 进一步证实这一结果。大量研究提示SMAD4在乳腺癌的发生、发展中起着重要作用，深入研究SMAD4的功能对阐明乳腺癌发病机制具有临床价值[9-10]。

本组通过SBI公司第4代慢病毒包装系统，利用干扰在线设计网页，设计3对针对SMAD4的短发卡RNA，并成功包装成干扰慢病毒。经RT-PCR和Western-blot发现3对短发卡RNA对SMAD4均有干扰效果，shRNA-SMAD4-1(52.17%)、shRNA-SMAD4-2(46.33%)、shRNA-SMAD4-3(40.18%)。shRNA-SMAD4-3干扰效果最好，干扰慢病毒的成功构建为后续研究SMAD4功能作出良好铺垫工作。

慢病毒病毒载体作为一种有效的基因工程载体，已证实其可用于基因治疗、免疫治疗及基础生物学研究的有力工具。作为基因载体，其具有较多优点，如可以制备较高滴度慢病毒，所携带的基因表达水平高，所感染的宿主细胞和组织范围广，几乎可以干扰所有细胞，慢病毒可以整合到基因组，能够形成稳定的基因表达，今后可用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、神经系统疾病、血液系统疾病的基因治疗。本实验采用SBI安全性更高的第4代慢病毒包装系统，为以后的实验研究奠定了良好的基础。

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SMAD4 shRNA interference lentivirus build and analysis

LiChen-wei

(ThePeople′sHospitalofChongqingYubeiDistrict,Chongqing401120,China)

Objective To construct the recombinant Lentivirus vector interfering human SMAD4 gene for the further research of BMPs/SMAD cell signal.Methods ShorthairpinRNA (shRNA) targeting SMAD4 gene was designed and DNA template was synthesized and subcloned into the Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1.The recombinant plasmid pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 was confirmed by PCR and gene sequencing.Then pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 and Lentiviral packaging plasmid was transfected into HEK293 cells for packaging by liposome.And collected Supernatant culture medium medium to infected MDA-MB-231 breast cancer cells.shRNA-SMAD4 was identified by RT-PCR and Western blot.Results (1) The gene sequence of shRNA targeting SMAD4 gene was obtained.(2)The recombinant Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 and were successfully constructed.(3)The recombinant Lentivirus vector shRNA-SMAD4 could be packaged in HEK293T and infected MDA-MB-231 Successfully.(4) The expression of SMAD4 gene was reduced in the breast cancer MDA-MB-231cells infected by shRNA-SMAD4.Conclusion The recombinant Lentivirus vector shRNA-SMAD4 was successfully constructed which could inhibit the expression of SMAD4.

recombinant lentivirus vector； shRNA； human SMAD4

李忱炜，男，硕士，检验技师，主要从事细胞信号通路、肺炎链球菌致病机制研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.035

A

1672-9455(2015)11-1582-03

2014-12-15

2015-02-08)