应用二醋酸酯荧光素与碘化丙啶的流式细胞术分析三种细菌的活性

罗燕飞 范小斌 龚彩平 周茂华 冼璐桦 林婷 甘慧泉

(广东省医学科学院 广东省人民医院检验科， 广东 广州 518000)

·论著·

应用二醋酸酯荧光素与碘化丙啶的流式细胞术分析三种细菌的活性

罗燕飞 范小斌 龚彩平 周茂华 冼璐桦 林婷 甘慧泉

(广东省医学科学院 广东省人民医院检验科， 广东 广州 518000)

目的:探讨在流式细胞术中应用二醋酸酯荧光素(FDA)与碘化丙啶(PI)分析金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌活性的性能。 方法:选取对数生长期金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌临床分离株各20株，制备1麦氏浊度菌悬液2支(约2 ml/支)；1支于85 ℃水浴30 min灭活，获取死菌菌液；分别应用FDA(0.5 μg /mL)、PI(5 μg/mL)两种荧光染料对死、活菌菌液进行染色(两种染料的染色时间分别为30 min 和15 min)；以不染色死菌液作为对照，应用流式细胞术检测经两种染料染色死、活菌菌液及不染色死菌液的平均荧光强度(FMI)，对比分析其FMI均值水平。 结果:以FDA为染料，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的无染料管、活菌管、死菌管FMI均值水平无差别，结核分枝杆菌活菌管FMI均值水平(129.61±8.69)明显高于死菌管(3.34±0.11)及无染料管(0.33±0.02)；以PI为染料，结核分枝杆菌的无染料管、活菌管、死菌管FMI均值水平无差别，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的死菌管FMI均值水平[(48.33±2.13)、(25.92±1.21)]明显高于活菌管[(1.87±0.12)、(2.14±0.07)]和无染料管[(1.14±0.09)、(1.12±0.04)]。结论:FDA能较好指示结核分枝杆菌活性，PI能较好指示金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的活性。

流式细胞术；微生物活性检测；荧光染料；金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌；结核分枝杆菌

目前通过使用特定的荧光染料染色、根据所测得的荧光强度的变化来判断经抗生素处理后的存活状态推断最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的流式细胞技术药敏试验(flow cytometry susceptibility testing，FCST)的研究国内外时有报道[1-2]。在前期应用碘化丙啶(PI)对金黄色葡萄球菌FCST的小样本量实验中，本组观察到了不太稳定的结果，PI染色能否良好检测金黄色葡萄球菌的活性？为此，本组选择金黄色葡萄球菌(一种革兰氏染色阳性菌)、大肠埃希菌(一种革兰氏染色阴性菌)及结核分枝杆菌(一种抗酸染色阳性菌)为研究对象，应用流式细胞术(flow cytometry，FCM)对PI及常与PI搭配使用鉴定细菌活力的二醋酸酯荧光素(FDA)鉴别生、死细菌的能力进行了初步分析，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 试验菌株

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌临床分离株各20株均来自我院就医患者临床分离菌。

1．2 菌悬液制备

应用一次性无菌接种环在血平板(购自广州市迪景微生物科技有限公司)上刮取生长约24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌单个菌落或Middlebrook 7H10固体培养基(美国BD公司产品)培养3～4周的结核分枝杆菌生长菌落，移入经低温消毒灭菌并预先装有无菌生理盐水的玻璃试管壁上，用接种环轻柔研磨菌落至乳糜状，充分摇匀菌液，用无菌300目不锈钢细胞筛网过滤，得到菌悬液。再用比浊仪(PhoenixSpecTM，美国BD公司产品)测定菌悬液浊度，并用无菌生理盐水将菌悬液调整为1麦氏浊度，将菌液分成2管。

1．3 荧光染料染色

依据参考文献[3]、[4]结合本组前期的初步摸索制定荧光染料染色实验方案。主要包括：配制浓度分别为0.5 μg/mL、5 μg/mL的FDA、PI两种荧光染料(均为sigma公司产品)工作液；分别取上3种细菌菌的死菌、活菌菌悬液200 μL与200 μL荧光染料工作液充分混匀封口，同时，准备一份未加荧光染料工作液的菌悬液作为阴性对照；含FDA管置于37℃培养箱避光孵育30 min，含PI管置于37 ℃培养箱避光孵育15 min。

1．4 流式细胞术检测

在美国BD公司FACScalibur流式细胞仪上进行。主要实验步骤有：用荧光微球对仪器进行光路和液流系统的校准，保证仪器各项指标在允许范围；设前向角(FSC)和侧向角(SSC)的信号值为对数放大，根据FSC/SSC的信号情况调节电压；选用FSC log、SSC log、FL1 log、FL3 log等参数，找到细菌最集中的区域设门，同时建立直方图以计算FL1通道上的平均荧光强度(MFI)。具体操作参照仪器和试剂说明书进行，流式检测试剂应用贝克曼公司流式细胞仪用原装产品。每份样本检测5次，取平均值作为检测结果。

1．5 统计学处理

2 结 果

表1 20株金葡萄球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌的平均荧光强度±s)

3 讨 论

流式细胞术是一种可对单个细胞或生物微粒进行快速定性、定量分析与分选的一门技术，具有准确、灵敏、快速、可同时进行多参数分析等优点。目前其在微生物学中的应用非常广泛，如病毒抗原抗体检测、细菌抗原抗体检测、抗生素敏感性试验、抗生素后效应、细菌性耐药异质性检测等[5]。本组结果显示：应用FDA可以准确鉴别死、活结核分枝杆菌，而PI则不能区分；PI能准确指示黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的死活状态，而FDA则不具此能。因此，荧光染料的优化选择与合理应用是为应用流式细胞术鉴别细菌活力或进行曲FCST技术关键之一。

FDA为膜渗透性染料，其本身不具荧光，进入细胞后可与胞内非特异性酯酶水解，释放出能发黄绿色荧光的荧光素分子[6]。本研究结果提示：活结核分枝杆菌细胞内含有丰富的能与FDA结合的非特异性酯酶，而死结核分枝杆菌细胞内该酶失活，黄色葡萄球菌、大肠埃希菌细胞内则不含此酶。PI为膜非渗透性染料，只能在细菌细胞受损时方可渗入细胞内嵌入DNA碱基对中与之结合发出荧光[6]。加热灭活金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，可使其细胞严重受损而致膜通透性发生根本性变化，因此其死菌管MFI显著高于活菌管。但是结核分枝杆菌细胞壁厚，加热灭活细菌也不能破坏其细胞壁，可能为PI染料不能指示结核分枝杆菌死活的根本原因。

另外，已如篇首所述，本研究的动因是在应用流式细胞术进行金黄色葡萄球菌药敏实验中本组观察到了不稳定的结果。而综观表1中的±s，无论FDA还是PI，其s均较小，显示出观察值与样本均数的离散程度较小，结果应属相当稳定。如何正确理解其间的相悖？本组认为原因可能有二：一是抗生素与细菌的短暂接触对细菌的活性影响程度不如加热灭活细菌，前者中可能存在“半死不活”的细菌，且其存在数量具有相当的不确定性；二是药敏测试菌本来就是敏感与耐药菌的混合，与药物接触后形成死、活菌混成菌液，进而影响实验测定。这些均为应用流式细胞术进行药物抗菌效应检测、细菌耐药异质性检测等研究中需要关注的问题。

[1] Martinez OV, Gratzner HG, Malinin TI, et al. The effect of some beta-lactam antibiotics on Eacherichia coli studied by flow cytometry[J]. Cytometry, 1982, 3(2): 129-133.

[2] 付 亮,龙 军,袁小澎. 流式细胞术快速检测产超广谱β-内酰胺酶细菌的研究[J].广东医学,2011,32(4):416-418.

[3] 张明霞,梅国华,熊顺景,等. 应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验[J].医学综述,2009,15(4):616-618.

[4] Mortimer FC, Mason DJ, Gant VA. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes[J]. Antimicrob Agents Chemother. 2000,44(3):676-681.

[5] 杨怀德,张才军,李秀义,等.流式细胞术在微生物学中的应用[J].医学综述,2006,12(13):825-827.

[6] 吴长有主编.流式细胞术的基础和临床应用[M].北京:人民卫生出版社,2014:209-226.

(本文编辑:郑颖)

Flow cytometry for viability analysis of three bacteria species with fluorescein diacetate vs propidium iodide staining

LuoYanfei,FanXiaobin,GongCaiping,ZhouMaohua,XianLuhua,LinTing,GanHuiquan

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialPeople’sHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou518000,China)

Objective:To analysis the viability of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis by using flow cytometry with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI) staining. Methods：Each 20 strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Mycobacterium tuberculosis during the logarithmic phase of growth were selected. Two tubes of bacterial suspension with Maxwell turbidity 1 (about 2 mL/tube) for each bacterium were prepared, with one for viable, and the other for dead bacteria (deactivated in water bath at 85 degrees Celsius for 30 min). The viable or dead bacteria were stained with FDA (0.5 μg/mL) for 30 min and PI (5 μg/mL) for 15 min, respectively. Using unstained dead bacteria as control, the mean fluorescence intensity (FMI) as measured by flow cytometry was compared between the viable and dead bacteria stained with the two dyes.Results：In terms of FDA staining, there was no difference in FMI of unstained tube, viable and dead bacteria between Staphylococcus aureus and Escherichia coli, whereas viable Mycobacterium showed significantly higher FMI (129.61±8.69) than dead (3.34±0.11) or unstained Mycobacterium (0.33±0.02). In terms of PI staining, there was no difference in FMI of unstained tube, viable and dead bacteria of Mycobacterium, whereas the dead bacteria of Staphylococcus aureus (48.33±2.13) and E. coli (25.92±1.21) showed significantly higher FMI compared with viable (1.87±0.12)and(2.14±0.07) and unstained (1.14±0.09)and(1.12±0.04) tubes of these bacteria, respectively. Conclusion：FDA can better indicate the viability of Mycobacterium tuberculosis, as PI can do for the viability of Staphylococcus aureus and Escherichia coli.

Flow cytometry; microbial activity detection; fluorescent dye; Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Mycobacterium tuberculosis

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.02.007

广东省医学科学技术研究基金(编号：A2012035)

罗燕飞,副主任技师。

R446.5

A

2095-9664(2015)02-0029-03

2014-10-11)

研究方向：血液肿瘤。