高效液相色谱法检测中药有效成分研究

马小强，霍生东

（1.通渭县畜牧兽医服务中心，甘肃 通渭743300；2.西北民族大学 生命科学与工程学院）

苦杏仁为蔷薇科植物山杏（学名：PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim）的干燥成熟种子。夏季采收成熟果实，除去果肉及核壳，取出种子，晒干，具有降气止咳平喘，润肠通便的功效。用于咳嗽气喘，胸满痰多，血虚津枯，肠燥便秘，其主要成分为苦杏仁苷。熟地为玄参科植物地黄（学名：Rehmannia glutinosa）的块根，又名熟地黄或伏地，经加工炮制而成。通常经反复蒸晒，至内外色黑油润，质地柔软粘腻，呈不规则的块状、碎块，大小、厚薄不一。表面乌黑色，有光泽，黏性大。质柔软而带韧性，不易折断，有光泽。无臭，味甜。熟地中的毛蕊花糖苷对神经有保护作用，对老年痴呆有一定效果。葛（学名：Pueraria lobata）是豆科葛属的植物，其根部为中草药葛根（中药拉丁名Puerariae Radix），又名鹿藿、黄斤、鸡齐根，主治伤寒温热、头痛项强（颈僵）、烦热消渴、泄泻、痢疾、麻疹不透、高血压、心纹痛、耳聋等，有效成分主要是葛根素。何首乌（学名：Polygoni multiflori），又名野苗、交藤、交茎、夜合、地精、桃柳藤、赤葛、九真藤、芮草、蛇草、陈知白、马肝石、九真藤、疮帚等，为蓼科多年生缠绕藤本植物。根细长，末端成肥大的块根，外表红褐色至暗褐色。何首乌中含2，3，5，4＇－四羟基二苯 乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷养心安神，祛风通络，补益精血、乌须发、强筋骨、补肝肾。高效液相色谱法（HPLC）和其他分离方法相比具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重复性好、操作方便等优点，在中药化学研究中得到广泛应用，并为中药分析研究工作提供了条件。在含量测定方面，几乎各种结构类型的中药活性成分均有使用高效液相色谱测定含量的报道，许多用薄层色谱不能分离的化合物，而用高效液相色谱却得到了很好的分离。本研究利用HPLC，对苦杏仁、熟地黄、葛根和何首乌等4 种中药的有效成分进行检测，为其质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

LC－10AT 型岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），苦杏仁产地甘肃、熟地黄产地河南、葛根产地陕西、何首乌产地陕西，乙腈为色谱专用，甲醛色谱专用，水为超纯水。

1.2 对照品溶液的制备

1.2.1 苦杏仁 取苦杏仁苷对照品43μg，精密称定，加甲醇制成每1mL含43μg的溶液，即得。

1.2.2 熟地黄 取毛蕊花糖苷对照品0.96μg，精密称定，加流动相制成每1mL 含0.96μg的溶液，即得。

1.2.3 葛根 取葛根素对照品82μg，精密称定，加30%乙醇制成每1mL中含82μg的溶液，即得。

1.2.4 何首乌 精密称取2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品0.218 mg，加稀乙醇制成每1mL含0.218mg的溶液，即得。

1.3 供试品溶液的制备

1.3.1 苦杏仁 称得本品粉末（过二号筛）0.2 545 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50kHz）30min；放冷后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.2 熟地黄 称得本品最粗粉约2.1 770g，置圆底烧瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，加热回流30min；放冷后再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50mL，减压回收溶剂近干，残渣用流动相溶解，转移至10mL 量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 葛根 称得本品粉末（过三号筛）约0.1 323 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，称定重量，加热回流30 min；放冷后再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.4 何首乌 取本品粉末（过四号筛）0.2g，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，称定重量，加热回流30min；放冷后再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，上清液滤过，取续滤液，即得。

1.4 最大吸收波长的选择

精密吸取对照品溶液与供试品溶液适量，以溶剂为空白，于紫外可见分光光度计上，在190～600 nm 波长处扫描最大吸收波长。结果可见，苦杏仁苷对照品溶液在207nm 处有最大吸收，供试品溶液在210nm 处有最大吸收，参考药典及相关文献，以207nm 作为测定波长；毛蕊花糖苷对照品溶液在334nm 处有最大吸收，供试品在334nm 处有最大吸收，参考药典及相关文献，以334nm 作为测定波长；葛根素对照品在250nm 处有最大吸收，供试品溶液在252nm 处有最大吸收，参考药典及相关文献，以250nm 为测定波长；2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品溶液在320nm 处有最大吸收，供试品溶液在320nm 处有最大吸收，参考药典及相关文献，以320nm 作为测定波长。

1.5 色谱条件与系统适用性

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，苦杏仁以乙腈－0.1%磷酸溶液（8：92）为流动相，波长207 nm，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7 000；熟地黄以乙腈－0.1%醋酸溶液（16：84）为流动相，检测波长为334nm，理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于5 000；葛根以甲醇－水（25：75）为流动相，检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不低于4 000；何首乌以乙腈－水（25：75）为流动相，检测波长为320nm，理论板数按2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－0－β－D－葡萄糖苷峰计算应不低于2 000。

2 结果与分析

2.1 线性关系

精密吸取各对照品溶液（0.208 mg／mL）2、5、8、10、12、15、20μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件记录峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘成标准曲线。苦杏仁苷回归方程为Y＝479 182 X＋7 188.8，r ＝0.9 999，表明苦杏仁苷在0.416～3.12μg范围内呈良好的线性关系；毛蕊花糖苷回归方程为Y＝2.01×106X＋1.94×104，r＝0.9 996，线性范围0.0 542μg～0.542μg；葛根素在7.7μg～123.2μg 范围内线性关系良好，回归方程Y＝0.0 336 ＋7.9 466 X，r ＝0.9 998；2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－0－β－D－葡萄糖苷回归方程Y＝6 109.3 X ＋0.8 212，r＝0.9 999，在0.372×10－3μg～22.320×10－3μg范围内呈良好线性关系。

2.2 精密度

精密吸取苦杏仁苷、毛蕊花糖苷、葛根素、2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，各连续进样5次，以峰面积积分值为测定指标，计算相对标准偏差，各对照品RSD 值分别为0.707%、0.57%、0.4%、0.50%，符合要求，方法、仪器精密度良好。

2.3 稳定性

精密吸取各供试品及对应的对照品各10μL，分别于0、2、6、10、15、24h注入高效液相色谱仪，以峰面积积分值为测定指标，测定稳定性，苦杏仁苷对照品RSD 为1.68%，供试品RSD 为2.01%，说明在24h内稳定性都较好；毛蕊花糖苷对照品RSD为0.64%，供试品RSD 为1.62%，说明在24h 内稳定性也较好；葛根素对照品RSD 为1.38%，供试品RSD 为0.17%，说明在24h内它们稳定性较好；2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品RSD 为1.24%，供试品RSD 为1.08%，说明在24h内稳定性都较好。

2.4 重现性试验

取同一产地的苦杏仁、熟地黄、葛根、何首乌各5份，按供试品溶液项下制备方法制备，依法测定，以有效成分峰面积为测定指标，计算样品含量，苦杏仁苷RSD ＝1.939%，毛蕊花糖苷RSD＝1.3%，葛根素RSD＝1.15%，2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷RSD＝0.99%，表明该方法重现性良好。

2.5 加样回收率试验

取已知含量（9.077mg／g）的苦杏仁样品6份，每份约0.22g，置具塞锥形瓶中，再分别加入苦杏仁苷对照品适量，按供试品溶液的制备项下操作。其平均回收率为97.25%，RSD 为1.06%。取6份同一批地黄，每份约1g，加入毛蕊花糖苷对照品溶液10mL（54.2mg／L），按上述供试品制备方法处理，进样测定峰面积，计算含量，毛蕊花糖苷对照品平均回收率为97.9%，RSD 为2.39%。精密称取已知含量的葛根样品5份，每份约3.50g，加入对照品，按供试品溶液的制备方法处理，平均回收率达到96.7%，RSD 为3.01%。取已知含量的样品，分别加入二苯乙烯苷对照品储备液适量，按样品制备方法制得样品溶液，表明2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D 葡萄糖苷的平均回收率为97.39%，RSD 为1.25%，可见回收率较好，此方法测定这四种中药材可行。

2.6 中药中有效成分的含量测定

精密称取苦杏仁0.2 545g，熟地黄2.1 770g，葛根0.1 323g，何首乌0.200g，按1.3供试品溶液的制备操作，按1.5 色谱条件与系统适用性测定。计算含量见表1。

表1 苦杏仁、熟地黄、葛根、何首乌有效含量测定结果

3 讨论

苦杏仁、熟地黄、葛根、何首乌在我国分布广泛，本研究主要测定这几种中药材中的有效成分，但由于受生长环境、栽培条件、采收时间和加工的影响，其有效成分有一定差异。《中华人民共和国药典》2010年版要求，苦杏仁含苦杏仁苷不得少于3.0%，熟地黄含毛蕊花糖苷不得少于0.020%，葛根含葛根素不得少于2.4%，何首乌含2，3，5，4＇－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷不得少于1.0%，本批次中药材均达到标准要求。

中药有效成分的提取及测定方法很多，许宁侠研究了苦杏仁中苦杏仁苷不同的提取及检测方法，苦杏仁苷的提取有水提法和乙醇提取法，化学发光法分析技术、电化学分析方法等属于间接法，其原理是通过水解或酶解把苦杏仁苷分解为苯甲醛、氢氰酸和葡萄糖，然后再测定相应分解物的含量，间接分析苦杏仁苷，适合微量检测。薄层扫描法属于直接法，是一种简捷快速的分析方法，灵敏度较高，可直接测定植物种子中的苦杏仁苷含量。本研究采用高效液相色谱法分离效率高，分析速度快，高效液相色谱法现已成为有机物定性定量分析研究的主要方法。熟地黄中多糖的提取方法也是多种多样，许春鹃等研究了用水提醇沉法、酶解提取法、超声提取法、超滤分离法、微波提取法等，表明水提醇沉法简便、稳定，但乙醇消耗量大；酶解提取法条件温和、简便、得率高，但酶的价格昂贵；超声波提取操快捷、提取时间短，缺点是超声波可能会破坏分子结构影响生物活性；超滤法工艺简单，但必须事先知道所要分离的物的相对分子量，才能有效选择超滤所用截留值的大小；微波加热法缺点是微波反应器的容量有限，难以大规模提取。范树国等对葛根提取有效成分提取试用了冷浸法、超声法、超声与冷浸结合使用法，超声提取20min的方法提取时间短，操作简单，适合微量检测。而只用冷浸提取48h的方法操作简单，对提取容器的损害较小，用于大规模提取是一种较好的方法。超声＋冷浸法使用法显著优于单一提取方法。周丽等研究了亚临界水提取葛根有效成分，具有省时、高效、环保的优点，是一种新型方法。关于何首乌有效成分的提取，卢照凯等研究的新工艺大大提高了提取纯度，主要是采用双组分纤维素酶前处理及渗漉提取，树脂柱层析及渗透浓缩和组合盐助析工艺。蔡丽芬等对不同产地的何首乌也进行质量检测，发现不同产地何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分含量存在着明显差异，对何首乌培养也提了一定建议。正规药厂对一批次的中药材都必须进行有效成分的检测，对于同一批不是同一产地的中药材也进行检测，对于不达标准的给予退回，可见中药材有效成分含量检测非常重要。本研究利用HPLC测定苦杏仁、熟地黄、葛根、何首乌中有效成分含量，表明该方法精密度高，稳定性好，重复性高，大大节省了各成分的测定时间及成本。

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