维药刺山柑抑制金黄色葡萄球菌生物膜的研究

徐琦等

[摘要] 目的 研究维药刺山柑提取及萃取物对金黄色葡萄球菌体外培养生物膜（BF）形成及清除作用的影响，为进一步开发维药刺山柑的应用价值及临床辅助治疗耐药性感染提供实验依据。 方法 通过醇提法获得维药刺山柑醇提物，并通过石油醚、乙酸乙酯及正丁醇的萃取获得不同极性的萃取物；使用96孔板培养金黄色葡萄球菌体外BF模型，采用试管二倍稀释法测定维药刺山柑不同提取物/萃取物的最低抑菌浓度（MIC），研究其对金黄色葡萄球菌BF形成的影响；同时通过检测维药刺山柑提取物对成熟BF中活菌数的影响，评价其对成熟BF的清除作用。 结果 维药刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC分别为52.50、50.00、45.00、46.25 mg/mL。当浓度分别为26.26、23.13、25.00、22.50 mg/mL时维药刺山柑醇提物及不同萃取物可在早期阶段干扰金黄色葡萄球菌BF的形成，致活菌数明显少于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），其中4倍MIC浓度的正丁醇萃取物抗菌活性明显，与青霉素组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），其中高浓度醇提物及正丁醇萃取物24 h清除BF的作用较强，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；维药刺山柑醇提物及不同萃取物还可以抑制并有效清除金葡菌成熟BF，其高浓度抗菌活性与青霉素比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 维药刺山柑醇提物及不同溶剂萃取物在体外具有抑制金黄色葡萄球菌BF形成的作用，并且能通过破坏已形成的BF起到杀灭细菌的作用，为临床辅助治疗耐药性金葡菌感染，提供实验依据。

[关键词] 金黄色葡萄球菌；维药刺山柑；生物膜

[中图分类号] R258.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（b）-0020-05

[Abstract] Objective To study the effect of Capparis spinosa. extract on Staphylococcus aureus′biofilm （BF） in vitro， and provide the experimental basis of clinical application. Methods The Capparis spinosa. extract by alcohol extraction was obtained， and the different polarity extracts was obtained by extraction with petroleum ether， ethyl acetate and n-butanol； the Staphylococcus aureus BF in vitro was induced by 96-well plates， the determination of the tube double dilution method was used to measure the minimal inhibitory concentrations （MICs） in different extracts/extraction from Capparis spinosa.， the impact of BF formation for Staphylococcus aureus was evaluated. At the same time， the evaluation of its scavenging effect on mature BF was done by detecting the impact of Uyghur medicine Capparis spinosa. extract on the number of living bacterium in mature BF. Results The MIC for Staphylococcus aureus in Capparis spinosa. alcohol extract， petroleum ether extraction， ethyl acetate extracts were 52.50， 50.00， 45.00， 46.25 mg/mL， respectively. When the concentration reached 26.26， 23.13， 25.00， 22.50 mg/mL， alcohol extraction， ethyl acetate and n-butanol samples could inhibit the formation of BF， the number of living bacterium was significantly less than the blank control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Among them， four times the concentration of MIC n-butyl alcohol extract antibacterial activity was significantly obvious， compared with Penicillin group， there was no statistically significant difference （P > 0.05）， the role of clearing BF of the high concentration of alcohol extract and n-butanol extract was stronger in 24 h， compared with the blank control group， there was significant difference （P < 0.05）； Uyghur medicine Capparis spinosa. alcohol extract and different extract could inhibit and effectively remove Staphylococcus aureus mature BF， compared with Penicillin， there was no statistically significant difference in its high antibacterial activity （P > 0.05）. Conclusion Capparis spinosa. alcohol extract ethyl， ethyl acetate and n-butanol samples can effevtively inhibit the BF′s formation of Staphylococcus aureus in vitro. It can also destroy the mature BF.

[Key words] Staphylococcus aureus； Uyghur medicine Capparis spinosa.； Biofilm

刺山柑（Capparis spinosa.）又名槌果藤，为白花菜科山柑属植物。维语称“波里克果”或“卡盘”等。该植物在我国新疆分布较广，以吐鲁番地区最多，此外，西藏、甘肃等局部地区也有少量分布[1-2]。据《新疆药用植物志》记载，刺山柑属食药两用植物，其叶子、花蕾、果实和根皮均能入药。维吾尔族民间常用其鲜果捣碎后外敷治疗疾病，其对痛风治疗总有效率达90%以上，是一种传统的维吾尔药。现代研究表明，维药刺山柑的化学成分包括生物碱类、黄酮类、挥发油类、脂肪类、聚戊烯醇类及吲哚类和脂肪族类芥子油苷等[3]。其具有抗菌消炎、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]及保肝[6]等活性。但刺山柑对于细菌生物膜（BF）的影响却未见相关报道。BF 是细菌为抵抗不利环境，所形成的一种独特的物质，由细菌及其分泌的多聚物组成[7]。它能够使细菌以非常精细的方式相互粘连，同时也能发挥屏障和占位性保护作用。细菌生物膜内细菌由于生物膜的保护，不容易被机体及抗生素清除，发生耐药性感染，常可导致疾病迁延不愈或急性发作，给临床治疗带来巨大困难。金黄色葡萄球菌是一种临床常见的重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起许多严重感染，也是在特定环境中极易形成生物膜的细菌。该菌是目前造成严重医院内感染的主要原因。本研究通过微孔法构建金黄色葡萄球菌生物膜体外模型，探讨维药刺山柑醇提取及不同极性萃取物对BF形成及清除的影响，为维药刺山柑临床应用提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

生物安全柜Thermo公司（1300 SERIES A2），Olypus光学显微镜，iMark酶标仪（Bio-Rad公司），37℃恒温培养箱（DNP-9162型），HH-S4恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），PL6001-S电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司），N001旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），SHB-3循环多用式水泵，SB-1000水浴锅（上海爱朗仪器有限公司），KQ-700DV型超声清洗器（昆山市超声仪器厂）。

1.2 试药

维药刺山柑系新疆吐鲁番药材干品，经新疆医科大学天然药物化学王晓梅副教授鉴定为白菜花科山柑属植物刺山柑的果实。

金黄色葡萄球菌（ATCC25923）为中国生物药品鉴定所提供。将购置的标准菌株接种于营养琼脂平板上，37℃、24 h进行复苏，传代备用。取培养6 h金黄色葡萄球菌菌液，经麦氏比浊浓度为1×106/mL，并用营养肉汤1000倍稀释，作为工作浓度。通过倾注平板法计数，得出金黄色葡萄球菌实验浓度为4×105/mL。

1.3 维药刺山柑样品的制备[8]

1.3.1 乙醇提取物的制备 维药刺山柑药材干品粉碎后取200 g药材干粉，加入95%乙醇1200 mL进行提取，分3次回流提取，每次2 h。合并提取液，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至少量浓缩液，将浓缩液倒入干燥平皿中，自然晾干，称重备用。石油醚萃取物：将所得的浸膏加蒸馏水浸泡溶解，然后倒入萃取装置中，加蒸馏水后加入180 mL石油醚，静置分层收集石油醚萃取液，反复3次，合并萃取液，随后用旋转蒸发仪浓缩，干燥后称重备用。

1.3.2 乙酸乙酯萃取物的制备 将石油醚萃取后所得的水相，加入乙酸乙酯萃取，反复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪浓缩，干燥后称重备用。

1.3.3 正丁醇萃取物的制备 将乙酸乙酯萃取后所得的水相，加入正丁醇萃取，方法同上，萃取物干燥后称重备用。

2 方法与结果

2.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

采用试管二倍稀释法测定维药刺山柑醇提物及不同萃取物对金黄色葡萄球菌MIC。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会[NCCLS（2004）]推荐标准[9]。结果显示，维药刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果分别为52.50、50.00、45.00、46.25 mg/mL，青霉素MIC为8×10-5 mg/mL。

2.2金黄色葡萄球菌生物膜微孔板模型的构建

实验步骤参照文献[10]稍作改进，将96孔平底微孔板四周加肉汤培养基作为空白对照，稀释为实验浓度的金黄色葡萄球菌菌液200 μL加入剩余微孔中，将微孔板置于37℃恒温培养箱中培养，24 h后金黄色葡萄球菌生物膜即可在微孔板底部形成，使用前用PBS反复冲洗。

2.3 统计学方法

所有实验数据均用应用SPSS 12.0统计学软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，行t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.4 维药刺山柑抑制金黄色葡萄球菌BF形成的作用

将实验浓度的金黄色葡萄球菌接种于96孔板，即从开始建立BF模型时就分别加入不同浓度的维药刺山柑醇提物，石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物，其初始浓度分别为420、400、360、370 mg/mL，以二倍稀释法稀释制备系列浓度的培养液加入微孔板，并设置不含药物的空白对照，24 h后测定光密度值（波长450 nm，波长570 nm），计算出细菌的抑制率，其公式为：抑制率（%）=（1-实验组/对照组）×100%[（溶剂空白值-样品值）/（溶剂空白值-阴性对照值）×100%][11]，并做活菌计数。结果显示，维药刺山柑对金黄色葡萄球菌生物膜形成有抑制作用。在构建金黄色葡萄球菌BF模型时，就分别加入维药刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物系列浓度培养液，并设置不含药物的空白对照。培养24 h后，微孔板底部表面黏附的活菌计数见表1，结果显示，维药刺山柑醇提物及不同极性的萃取物各浓度都具有显著的抗菌活性且呈剂量依赖性，各组与空白对照组比较，黏附活菌数明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05），其中石油醚萃取物的抗菌活性与醇提物及正丁醇萃取物相比较弱（P < 0.05），与乙酸乙酯萃取物相比，载体表面活菌数多但差异无统计学意义（P > 0.05）。维药刺山柑醇提物/萃取物的高浓度组（4×MIC组）抗菌活性明显，其中正丁醇萃取物高浓度处理组与青霉素处理组黏附活菌数差异无统计学意义（P > 0.05）。以上结果说明维药刺山柑醇提物及不同极性萃取成分都能在体外明显抑制金黄色葡萄球菌BF的形成，且高浓度正丁醇萃取物作用效果与青霉素效果相仿。

2.5 维药刺山柑对金黄色葡萄球菌BF的清除作用

构建金黄色葡萄球菌生物膜微孔板模型，24 h待金黄色葡萄球菌生物膜形成后，用PBS缓冲液冲洗。随后分别加入含维药刺山柑醇提物及萃取物系列浓度的培养液，并设置不含药物的空白对照及阴性对照，37℃培养。分别于8、18、24 h孵育1 h后弃去上清，PBS缓缓清洗3次，使用连续稀释法进行活菌计数，测定重复3次，计算平均值。药物作用后的金黄色葡萄球菌BF，经PBS反复清洗后，加入结晶紫染色30 min，随后将结晶紫倾出，清洗，加入95%的乙醇溶解生物膜，测定600 nm处的OD值，记录数据。不同浓度维药刺山柑醇提物/萃取物对成熟金黄色葡萄球菌BF的清除作用。构建金黄色葡萄球菌BF模型，24 h后不同浓度的维药刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物作用于已经形成的BF。结果显示，当维药刺山柑醇提物/萃取物浓度为0.5×MIC时，相应组的生物膜细菌计数在8、18、24 h时与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。当各组浓度达到1×MIC时，对金黄色葡萄球菌生物膜内细菌显示出抗菌活性，18 h内细菌计数与空白组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。当各组浓度增加至4×MIC时，培养8、18、24 h后金黄色葡萄球菌BF内活菌数明显减少，与空白组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中正丁醇萃取物处理组与石油醚及乙酸乙酯萃取物处理组BF内活菌数比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见表2，但24 h内BF中的细菌不能完全被清除。各时间段之间活菌数无显著性差异。以上结果说明维药刺山柑醇提物及不同极性萃取成分都能在体外有效清除金黄色葡萄球菌BF，且正丁醇萃取物作用效果最好。

3 讨论

近年来研究证实临床上部分迁延难愈的感染多源于细菌生物膜的形成，而金黄色葡萄球菌是导致慢性感染的主要致病菌之一[12]。金黄色葡萄球菌生物膜是细菌在不利的生长环境中形成的优势型，细菌菌体被其自身分泌的多种糖蛋白包裹，形成膜状物，阻碍药物的通透，从而导致不容易被机体及抗生素清除，发生耐药性感染。在特定环境中金黄色葡萄球菌是极易形成BF的细菌，一旦形成BF，常规剂量的抗生素作用无效，须加大药物剂量和延长用药时间，但伴随而来的是耐药菌株的产生[13]。抗菌药物的耐药问题被世界卫生组织认为是我们面临的重要健康问题。因此，寻找能够抑制细菌BF生长或清除BF的药物已成为研究热点。

多项研究表明，中药在防治细菌生物膜引起的感染方面有着特殊的优势，中药不仅可以抑制细菌生物膜的形成，清除已经形成的生物膜，其与抗生素联合应用还能增强抗生素的抗感染能力。同时，中药具有药材来源广，毒副作用小，药理作用强，在菌体内作用途径多样化，不易导致细菌耐药等优点，已成为继抗生素之后抗感染药物研究的热点[14]。刺山柑是一种天然食药两用草本中草药，原产于地中海沿岸，喜生于干旱有砂石的低山坡，沙地上，可以防风固沙，保护生态环境，具有很好的生态价值。该植物在我国新疆分布较广，以吐鲁番地区最多，此外，西藏、甘肃等局部地区也有少量分布。由于刺山柑具有多种药理活性，在新疆地区是一种常用的维吾尔药材，据《新疆药用植物志》记载，该植物的果实、枝叶和根皮均能入药，主要功能有消炎止痛、祛风、散寒及除湿。近年来有研究表明，刺山柑所含化学成分主要包括：生物碱类、黄酮类、挥发油类、脂肪类、聚戊烯醇类及吲哚类和脂肪族类芥子油苷等[15-16]。刺山柑药理活性具有多样性， 其花芽中的甲醇提取物具有较强的抗氧化活性[17]；果实具有降血脂、降血糖[18]，抑制真菌的作用；醇提物具有良好的抗菌消炎，抗肿瘤等活性等。但刺山柑对于细菌生物膜的影响却未见相关报道。本文就维药刺山柑乙醇提取物以及不同极性萃取物对金黄色葡萄球菌BF形成及清除作用的影响进行了初步探讨。结果显示，刺山柑提取物在体外能有效抑制金黄色葡萄球菌BF的形成，与临床用药青霉素相比效果差异无统计学意义。但由于维药刺山柑醇提物及萃取物由多种成分组成，其抑制BF形成及清除BF的作用很可能是多成分多途径的综合结果。其中的主要有效成分以及其抑菌的具体机制还有待今后进一步深入研究。

我国新疆地区维药刺山柑资源丰富，但目前没有得到充分利用，本文选用维药刺山柑果实研究其抗菌活性，对进一步研究其药理作用，提高其利用价值具有重要意义。相信随着科学技术的不断发展，对维药刺山柑的化学组成、药理效应及临床应用等方面的深入研究，会为维药刺山柑的应用开辟广阔的前景。

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（收稿日期：2014-10-09 本文编辑：卫 轲）