黄龙止咳口服液对咳嗽变异性哮喘模型大鼠白细胞介素4和γ干扰素的影响

陶 迪 司振阳 隆红艳 张 骠.南京中医药大学研究生院，江苏南京 009；.南京市中医院儿科，江苏南京 000；.南京市中医院中心实验室，江苏南京 000

黄龙止咳口服液对咳嗽变异性哮喘模型大鼠白细胞介素4和γ干扰素的影响

陶 迪1司振阳2▲隆红艳3张 骠2
1.南京中医药大学研究生院，江苏南京 210029；2.南京市中医院儿科，江苏南京 210001；3.南京市中医院中心实验室，江苏南京 210001

目的通过测定与分析各组大鼠血清及肺泡灌洗液（BALF）中γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）含量，观察黄龙止咳口服液对咳嗽变异性哮喘（CVA）模型大鼠免疫功能的影响，进而探讨黄龙止咳口服液调节CVA免疫功能紊乱的作用机制。 方法 利用卵蛋白（OA）和氢氧化铝共同激发致敏建立CVA大鼠模型，将大鼠分为正常组、模型组、黄龙高剂量组、黄龙中剂量组、黄龙低剂量组、先声咳喘宁组、布地奈德组，记录引喘诱咳时2 min内大鼠咳嗽次数及血清和支气管BALF中IL-4、IFN-γ含量。结果与正常组比较，模型组咳嗽次数明显增多（P＜0.01），血清和支气管BALF中IL-4含量显著升高（P＜0.01），IFN-γ含量降低（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组咳嗽次数均明显减少（P＜0.01），血清及BALF中IL-4含量明显降低，IFN-γ含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；黄龙高剂量组与黄龙低、中剂量组比较，咳嗽次数明显减少，血清及BALF中IL-4含量明显降低，IFN-γ含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与先声咳喘宁组比较，黄龙高剂量组血清IFN-γ值相对升高，BALF中IL-4值相对降低，IFN-γ值相对升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；与布地奈德组比较，黄龙高剂量组血清IFN-γ值相对升高，BALF中IL-4值相对降低，IFN-γ值相对升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论黄龙止咳口服液通过降低机体的IL-4含量、升高IFN-γ含量发挥治疗CVA的作用。

咳嗽变异性哮喘；白细胞介素-4；γ干扰素；支气管肺泡灌洗液；黄龙止咳口服液

咳嗽变异性哮喘 （cough variant asthma，CVA）是哮喘的一种潜在形式或特殊类型。现代中医文献根据发病特点及临床表现将其命名为 “哮咳”、“风咳”等。目前多数学者认为CVA与典型哮喘的发病机制相同，研究表明［1-2］：CVA与多种炎症细胞、炎症介质、细胞因子共同参与相互作用所致的慢性非特异性炎症的病理基础相吻合，其间接表现为气道高反应性。新近研究发现［3-4］，辅助性T淋巴细胞亚群（Th细胞）功能紊乱，可能是支气管哮喘发病中的一个重要环节。而Th细胞根据所分泌的细胞因子的不同，可进一步分为Th1和Th2两个亚型，γ干扰素 （IFN-γ）、白介素4（IL-4）分别是Th1和Th2的细胞因子。因此，研制具有调节IFN-γ/IL-4免疫功能的中药有重要意义。本实验通过观察黄龙止咳口服液对CVA模型动物血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ水平的影响，探讨CVA发病机制和黄龙止咳口服液的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级Wistar大鼠 （160～200 g）80只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 药物 黄龙止咳口服液，由炙麻黄、地龙、杏仁、紫苏子、桑白皮、前胡、旋覆花、蝉蜕组成，购自南京市中医院药剂科，用蒸馏水煎至生药1.5 kg/L，4℃冰箱保存。先声咳喘宁：江苏先声制药有限公司，国药准字Z32020967，规格10 mL/支。吸入用布地奈德混悬液（普米克令舒）：澳大利亚阿斯利康有限公司，批号3144771，规格1 mg/2 mL。

1.1.3 试剂 氢氧化铝干粉：南京市中医院药剂科提供。卵蛋白（OA）：美国Sigma公司（批号1001581887）；辣椒素 （纯度＞95%）：南京都莱生物技术有限公司（批号19404-86-4），取辣椒素30.5 mg，用吐温-80溶液及无水乙醇各1 mL溶解，加入生理盐水并稀释成1×10-4mol/L溶液；IL-4酶联免疫试剂盒：联科生物科技有限公司（批号：230430312）；IFN-γ酶联免疫试剂盒：联科生物科技有限公司（批号238030312）。

1.1.4 器材 402AI超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；自动洗板机（Bio-Tek ELX50）；酶标分析仪（Bio-Tek Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 CVA动物模型的建立 采用卵蛋白和氢氧化铝共同激发致敏的方法造模。将除正常组10只大鼠外，其余以配制的含卵蛋白1 mg和氢氧化铝10 mg的生理盐水1 mL作皮下注射。分别在两后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取10点，每点皮下注射0.05 mL，同时腹腔注射0.5 mL，共计1 mL，第8天重复1次以加强致敏。从第15天起，将大鼠置于密闭有机玻璃罩内，给予含1%OA溶液的生理盐水超声雾化激发20 min，以激发哮喘，以大鼠腹肌明显收缩为阳性，直到出现呼吸加深、加快等呼吸道痉挛症状，提示造模成功［5］。

1.2.2 分组与给药 将造模成功的大鼠随机分为7组（正常组、模型组、布地奈德组、先声咳喘宁组、黄龙高剂量组、黄龙中剂量组、黄龙低剂量组），每组10只。黄龙止咳口服液低、中、高剂量组给药浓度为0.75、1.5、3.0 kg/L；先声咳喘宁口服液组4.2 mL/kg灌胃给药；布地奈德组（0.12 mL/kg）配以等量的生理盐水雾化吸入给药；正常组及模型组同步用1 mL/100 g蒸馏水灌胃。大鼠给药剂量按60 kg成人体表面积换算而来。连续给药14 d，第15天处死动物。

1.2.3 指标检测 ①咳嗽次数测定方法：将每组大鼠放置在密闭箱内，记录2 min内雾化吸入浓度为1×10-4mol/L辣椒素溶液后的咳嗽次数，将给药2、4、6 d内数据进行统计测定。②血清中IL-4、IFN-γ的含量：腹主动脉取血4 mL，标本由无菌干燥管收集，静置1 h后，4℃2000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃以下保存，测定方法严格按照酶联免疫试验试剂盒说明书操作。③BALF中IL-4、IFN-γ的含量：左肺行支气管肺泡灌洗术，分3次进行，分别灌入生理盐水4、3、3 mL，共计10 mL。将3次收集的BALF混合均匀，再以1500 r/min离心5 min，取上清液，-20°C保存，测定方法严格按照酶联免疫试验试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

用SPSS 16.0软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；除正常对照外，其余各组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠咳嗽次数的测定结果比较

用药后第2、4、6天，与正常组比较，模型组咳嗽次数明显增多（P＜0.01），提示造模成功。用药后第2、4、6天，各治疗组咳嗽次数与模型组比较均明显减少（P＜0.01），提示各治疗组药物都具有止咳的功效。用药后第6天，黄龙各剂量组与先声咳喘宁组、布地奈德组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示治疗组药物之间止咳作用程度相似。黄龙高剂量组与低、中剂量组比较差异有高度统计学意义 （P＜0.01），提示黄龙止咳口服液在改善咳嗽症状方面呈现一定的剂量依赖性。见表1。

2.2 各组大鼠血清中IL-4和IFN-γ的检测结果比较

与正常组比较，模型组血清IL-4值明显升高，而IFN-γ值明显降低（P＜0.01），提示IL-4、IFN-γ与CVA的发病密切相关；与模型组比较，各治疗组的血清IL-4值明显降低，IFN-γ值明显升高 （P＜0.05或P＜0.01），提示各治疗组均对CVA有一定的治疗作用；与黄龙高剂量组比较，先声咳喘宁组IFN-γ值相对降低（P＜0.01）；布地奈德组IFN-γ值相对降低（P＜0.05），提示在调节血清IFN-γ含量水平，黄龙高剂量组优于先声咳喘宁和布地奈德组；黄龙高剂量组IL-4和IFN-γ含量与其低、中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示在调节血清中显示一定的量-效关系。见表2。

2.3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ含量的检测结果比较

与正常组比较，模型组BALF中IL-4值明显升高，而IFN-γ值明显降低（P＜0.01），提示CVA发病可影响BALF中IL-4和IFN-γ的含量；与模型组比较，各治疗组BALF中IL-4明显降低，IFN-γ明显升高（P＜0.05或P＜0.01），提示各治疗组均能起到一定的治疗作用；与黄龙高剂量组比较，先声咳喘宁组、布地奈德组BALF中IL-4值相对升高，IFN-γ值相对降低（P＜0.01），提示黄龙治疗组在调节BALF中IL-4和IFN-γ含量优于其他治疗组；黄龙高剂量组与低、中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），显示一定的量-效关系。见表3。

3 讨论

本方在中医整体观念、辨证论治原则的指导下，针对CVA患儿的病机多为风痰痹阴、肺热气逆的特点，确定了祛风解痉、宣肺化痰、清气降逆的基本治法，方中炙麻黄有宣肺平喘、祛风降气之功；地龙有清肺平肝、平喘通络之功，为清热解痉、止咳平喘之要药，两药相合宣降并举、解痉平喘，使肺气宣达通畅，则咳自止喘自平，共为君药。杏仁有宣肺降气、止咳化痰之功。紫苏子有利肺平喘、下气止咳之功。桑白皮有清肺泄热、止咳平喘之功。前胡有宣肺降气、降气化痰之功，四者均为臣药。旋覆花、蝉蜕为佐使之药，其中旋覆花有降气消痰、和中止逆之功，为治疗呛咳之要药。蝉蜕有清热宣肺、祛风解痉之功，为治疗刺激性干咳与痉咳之要药。诸药合用，宣降同施，温润并用，相辅相成，共奏清热宣肺、祛风解痉、顺气化痰、降逆止咳之功，使风去热清、气顺痰消而咳嗽自愈。本课题前期研究结果表明［6］，黄龙方治疗小儿CVA（风热夹痰证）在改善患儿总体疗效、主症、次症及证候等诸方面均优于对照组，显示了中医药治疗本病的优势。

现代医学研究认为［7-8］，CVA其发病与免疫因素有关。细胞免疫方面发现哮喘的免疫功能实质是Th1/ Th2亚群功能失调，表现为Th1功能不足，Th2功能亢进。研究表明［9］，纠正Th1/Th2功能失衡，可以减轻气管哮喘的症状。IFN-γ在支气管哮喘中起保护作用，在Th1细胞因子中具有促进炎性反应，较强的抗病毒、抗细菌感染和抗寄生虫感染，加强宿主的防御和参与免疫调节的作用，其分泌减少与哮喘的发生关系密切［10-11］。而Th2主要分泌IL-4等细胞因子与IgE合成、嗜酸细胞的浸润和激活密切相关，参与CVA变应性炎症的发生和发展，被认为是Th2转化的必需因子，并抑制Th1细胞的效应功能［12］。

CVA患儿以咳嗽为主要临床表现。实验结果显示模型组大鼠的咳嗽次数多于正常组（P＜0.01），证实造模成功。用药后第2天，各治疗组咳嗽次数与模型组比较均减少 （P＜0.01），说明各治疗组均有效缓解CVA大鼠的咳嗽症状。用药后第6天，黄龙各剂量组与先声咳喘宁组、布地奈德组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明治疗组药物之间止咳作用程度相似。黄龙剂量组间比较，高剂量组与低、中剂量组比较有显著性差异（P＜0.01），说明随着黄龙剂量的增加，止咳效果更加明显。

对血清中IL-4、IFN-γ含量的影响实验结果显示：连续给药治疗14 d后，与模型组比较，各治疗组血清IL-4指标含量明显降低、IFN-γ含量升高 （P＜0.01），说明IL-4、IFN-γ与CVA的发病密切相关。治疗方面，黄龙高剂量组与低、中剂量组比较，IL-4含量明显降低，IFN-γ含量明显升高（P＜0.05），说明随着黄龙止咳口服液剂量加大，治疗CVA的效果更显著，黄龙止咳口服液对CVA治疗作用具有量效关系。与先声咳喘宁组和布地奈德组比较，黄龙高剂量组血清中IFN-γ含量较高，差异有高度统计学意义 （P＜0.01），而血清中IL-4含量低，无统计学差异，说明在调节血清IFN-γ含量水平，黄龙高剂量组优于先声咳喘宁和布地奈德组，其调节血清中IL-4含量水平与先声咳喘宁和布地奈德相似。疗效方面，与正常组比较，先声咳喘宁组和布地奈德组在调节血清IL-4、IFN-γ的含量有显著性差异（P＜0.05），说明其一定程度上缓解CVA病情，使其接近正常水平。而黄龙高剂量组与正常组比较无显著性差异（P＞0.05），说明其疗效优于其他对照组，从而达到治疗CVA的目的。

对支气管BALF中IL-4、IFN-γ的影响实验结果显示：BALF中IL-4指标含量明显降低、IFN-γ含量升高，说明BALF中IL-4、IFN-γ的含量水平与CVA的发病密切相关。治疗方面，黄龙高剂量组与低、中剂量组比较，IL-4含量明显降低，IFN-γ含量明显升高，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），说明黄龙止咳口服液对CVA治疗作用具有量效关系。与布地奈德组比较，黄龙高剂量组BALF中IL-4含量低，有显著性差异 （P＜0.01），IFN-γ含量高，但无统计学差异，说明在调节BALF中IL-4水平优于布地奈德组，在调节IFN-γ水平与其相似。与先声咳喘宁组比较，黄龙高剂量组BALF中IL-4含量低，IFN-γ含量高，无统计学差异，说明两者通过调节BALF中IL-4、IFN-γ含量达到治疗CVA的目的水平相似。疗效方面，与正常组比较，先声咳喘宁组和布地奈德组调节BALF中IL-4、IFN-γ含量有显著性差异（P＜0.05），说明其一定程度上缓解CVA病情，使其接近正常水平。而黄龙高剂量组与正常组比较无显著性差异（P＞0.05），说明其疗效优于其他对照组，从而达到治疗CVA的目的。

从本实验可以看出，黄龙止咳口服液可以明显改善CVA咳嗽症状，通过调节血清及BALF中IFN-γ和IL-4含量达到治疗CVA的目的，且疗效优于其他对照组。与模型组比较，治疗组的血清及BALF中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高，可能是通过降低机体IL-4水平，升高机体IFN-γ水平，以调控Th1向Th2细胞分化，引起Th1细胞的减少，从而减轻气道炎症，抑制气道重塑有关，这可能是黄龙止咳口服液治疗CVA的机制之一。由于中药复方成分复杂，作用靶点繁多，因此，实验初步证实了黄龙止咳口服液可调节Th1/ Th2功能失衡，其治疗CVA的深层次机制有待进一步开展。

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Effect of Huanglong Cough Liquid on interleukin-4 and interferon-γ of cough variant asthma of model rats

TAO Di1SI Zhenyang2▲LONG Hongyan3ZHANG Biao2
1.Graduate School,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210029,China; 2.Department of Pediatrics,Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210001, China;3.Central Laboratory,Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu Province,Nanjing 210001, China

ObjectiveBy measuring and analyzing the content of interferon-γ(IFN-γ),interleukin-4(IL-4)of serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF)in rats of all groups,to observe the effect of Huanglong Cough Liquid on immunologic function of cough variant asthma (CVA)of model rats,so as to investigate the mechanism of Huanglong Cough Liquid in adjusting the immune dysfunction of CVA.Methods The egg albumin (OA)and aluminum hydroxide were used to motivate sensitization to establish CVA model of rats,and the rats were divided into normal group,model group,high dose of Huanglong group,medial dose of Huanglong group,low dose of Huanglong group,Xiansheng Kechuanning group,Budesonide group.The cough times and contents of IFN-γ,IL-4 of serum and bronchus BALF at inducing dyspnea with cough whin 2 min were recorded.Results Compared with normal group,the cough times of model group were increased significantly (P＜0.01),the content of IL-4 of serum and bronchus BALF was increased significantly(P＜0.01),the content of IFN-γ was decreased significantly(P＜0.01);compared with model group,the cough times of all groups decreased significantly(P＜0.01),the content of IL-4 of serum and BALF was decreased significantly,the content of IFN-γ was increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01);compared with low,medial dose of Huanglong group,the cough times of high dose of Huanglong group were decreased significantly,the content ofIL-4 of serum and bronchus BALF was decreased significantly,the content of IFN-γ was increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01);compared with Xiansheng Kechuanning group,the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively,the content of IL-4 of BALF was decreased relatively,the content of IFN-γ was increased relatively,the differences were statistically significant(P＜0.01); compared with Budesonide group,the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively,the content of IL-4 of BALF was decreased relatively,the content of IFN-γ was increased relatively,the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Huanglong Cough Liquid play a treatment role in CVA by decreasing the contents of IL-4 and increasing the contents of IFN-γ.

Cough variant asthma;Interleukin 4;Interferon-γ;Bronchoalveolar lavage fluid;Huanglong Cough Liquid

R562.25

A

1673-7210(2015)01(b)-0008-05

2014-09-19本文编辑：张瑜杰）

江苏省中医药局科技项目（编号LZ13100）。

陶迪（1988-），女，南京中医药大学 2012级中医儿科学专业在读硕士研究生；研究方向：小儿肺系疾病。

▲通讯作者