基于转录组平台的蛤仔微卫星标记筛选

闫路路，秦艳杰，闫喜武，王琳楠，毕成隆，张津源

大连海洋大学， 水产与生命学院, 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心, 大连 116023

基于转录组平台的蛤仔微卫星标记筛选

闫路路，秦艳杰，闫喜武*，王琳楠，毕成隆，张津源

大连海洋大学， 水产与生命学院, 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心, 大连 116023

以菲律宾蛤仔转录组测序所得拼接序列为基础，采用MISA软件进行微卫星分析，对其中的145个微卫星位点进行引物设计，得到具有清晰扩增条带的微卫星位点58个。对大连庄河野生蛤仔群体的扩增结果表明，18个位点显示单态性，40个位点表现为多态性。该群体40个多态性微卫星位点得到的等位基因数在2—6之间，平均等位基因数为3.4250±0.9718，观测杂合度和期望杂合度分别在0.0000—1.0000和0.0615—0.7996之间，平均值分别为0.2727±0.2272和0.4739±0.1902，群体平均Nei指数为0.4664±0.1872。多态信息含量(PIC)在0.0586—0.7529之间，平均值为0.4148±0.1707，其中16个微卫星位点的PIC值大于0.5，为高度多态性，15个位点0.25 < PIC<0.5，为中度多态性，其余9个为低度多态性。经Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验，有10个位点尚未偏离平衡。基于转录组平台筛选微卫星标记的方法，在很大程度上推动了DNA分子标记的开发。研究开发的微卫星标记可用于蛤仔群体遗传学、遗传连锁图谱构建及其他相关研究，为蛤仔分子标记辅助育种及群体种质保护等工作提供技术支持。

菲律宾蛤仔；转录组；微卫星；遗传多样性

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)又称蛤仔[1]，具有生长快、周期短、适应强等特点，是我国四大养殖贝类之一，也是世界主要养殖贝类之一。据FAO(Food and Agriculture Organization)统计，2011年世界蛤仔产量为368多万t。我国年产量约300多万吨，占世界总产量的90%以上，占我国海水养殖总产量的20%，贝类产量的30%[2]。现阶段，菲律宾蛤仔正面临着育种方式单一和病害防治难等问题，以转录组平台为基础，开发一系列微卫星标记[3- 4]，可为系统开展蛤仔物种遗传多样性的研究奠定基础，也将有助于蛤仔标记辅助育种工作的开展。微卫星，又称简单重复序列(SSR)[5]，具有高稳定性、高多态性、引物通用性、位点特异性、检测方便和呈共显性遗传等特点[6- 7]，是广泛应用于水产动物遗传多样性分析[8]、遗传图谱构建[9]、雌核发育[10]、基因定位及克隆[11]、亲权鉴定[12]等的理想分子标记。菲律宾蛤仔微卫星引物的开发和遗传多样性分析有一系列相关报道，如闫喜武[13]等利用微卫星标记对3个地区蛤仔群体进行遗传多样性分析。虞志飞等人[14]利用SSR引物查明年龄结构对蛤仔遗传多样性的影响。2007年N. YASUDA[15]等人用9对引物对菲律宾蛤仔进行遗传多样性分析。2009年韩国学者Hye Suck An[16]等人利用13个微卫星标记位点对菲律宾蛤仔进行遗传多样性研究。由于引物开发的局限，目前蛤仔尚没有足够的微卫星标记用于相关遗传学研究。

蛤仔转录组数据平台可以提供大量EST(expressed sequence tags)数据，且直接与功能基因密切相关。本文将转录组测序所得数据用于蛤仔微卫星标记开发、筛选和遗传多样性分析，此研究将为蛤仔遗传图谱的构建、亲权鉴定、QTL(quantitative trait locus)定位等提供批量的微卫星位点，并为蛤仔的分子标记辅助育种和种质保护等工作提供强有力技术支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验材料为采自大连庄河的32个野生菲律宾蛤仔个体。壳长为(1.5±0.2) cm。

1.2 基因组DNA的提取

分别剪取32只蛤仔的足100 mg左右，于离心管中剪碎，采用常规的酚/氯仿抽提的方法[16]提取DNA，后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量(golden view染色)。模板DNA保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.3 微卫星序列的来源

根据罗氏454公司的Genome Sequencer (GS) 高通量测序得到的所有数据进行reads长度频数的统计，使用软件SeqClean(Lastest86_64版本)和Lucy(1.20p版本)处理原始数据，去掉接头和引物序列，保留50 bp长度的序列。利用454 Newbler2.5.3软件去除低质量区域序列，将保留的50 bp长度的序列进行拼接，将拼接得到的序列用MISA软件进行SSR分析。对于非混合型SSR位点，设置条件为单碱基类型重复至少10次，2碱基类型重复至少6次，大于等于3个碱基类型的SSR其重复单元至少重复5次。在此基础上，如两个SSR位点间距离小于100 bp，则认为这两个SSR位点组成一个混合型SSR位点。

1.4 引物设计与合成

挑选以三碱基为重复单元的微卫星标记序列设计引物，引物长度在18—22 bp之间，GC含量在40%—60%之间，扩增目的片段长度在100—500 bp之间，引物需在序列保守区内。共设计145对菲律宾蛤仔微卫星引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.5 PCR扩增及产物检测

PCR反应体系(10 μL)：基因组DNA 2 ng、10×Easy Taq Buffer 1 μL(20 mmol/L Mg2+)、Easy Taq DNA 聚合酶 0.2 μL (5 units/μL)、dNTP 0.8 μL (0.2 mmol/L)、引物各0.4 μL(0.4 μmol/L)。PCR反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 40 s，最适退火温度下40 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经12%的非变性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺体积比为29∶1)凝胶电泳分离PCR反应产物，电泳液为1×TBE缓冲液，电压300 V，电泳时间约为2 h(北京六一仪器厂DYY-Ⅱ型电泳仪，DYCZ- 30型电泳槽)，硝酸银染色后用凝胶成像仪成像。

1.6 菲律宾蛤仔SSR引物的筛选及遗传多样性分析

实验利用12个大连庄河野生个体对145对引物进行初筛，在预设退火温度(PP5软件推荐温度)±3 ℃区间内，设置12个温度梯，按照上述PCR反应条件和产物检测方法进行PCR扩增和检测，以出现清晰条带、主带清楚为标准，筛选每对引物最适退火温度和可用引物。

将能够获得清晰条带的微卫星位点用于野生蛤仔遗传多样性分析，以32个野生蛤仔DNA样品为模板，按照上述PCR反应体系和条件进行PCR扩增，其中最适退火温度为引物初筛得到的退火温度。最后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，并对扩增结果进行拍照。

1.7 数据统计与分析

群体扩增结果统计时，将每个位点所有条带按照片段从小到大依次命名为A, B, C,…，即为等位基因，并按照每个个体的带型统计出基因型。利用PopGene32软件统计每个微卫星位点的等位基因数 (Allele number,Na),观测杂合度 (observed heterozygosity,Ho),期望杂合度 (expected heterozygosity,He) 和香农一威纳指数(Shannon-Wiener Index,H),并计算多态信息含量 (polymorphism information content, PIC)。具体参数的计算方法如下：

2 结果

2.1 转录组中微卫星标记分析

利用MISA软件，将拼接得到的序列进行微卫星标记分析，结果如表1所示。

表1 SSR标记分析结果Table 1 Output statistics of SSR (simple sequence repeats)

2.2 菲律宾蛤仔SSR引物筛选结果

初筛结果中，共58对引物出现清晰扩增条带，且杂带少易于鉴别等位基因。在32个蛤仔个体中的扩增结果发现，18对引物表现为产物单一条带(图1c)，另40对引物能够分别在32个庄河自然野生蛤仔个体中扩增出清晰、稳定的DNA目的片段，在蛤仔野生群体中可表现出不同程度的多态性，并能对其进行准确的基因分型(图1a,b)。呈现多态性的40个位点中，15个位点出现3个等位基因，13个位点出现4个等位基因，7个位点出现2个等位基因，4个位点出现5个等位基因，1个位点出现6个等位基因。上述58对SSR引物，其退火温度在43—59 ℃范围内，扩增产物片段大小在117—605 bp之间，均是以三碱基为重复单元的序列，其中有8个微卫星位点以TTG为重复单元，有6个位点以TGG为重复单元，以ATC、TGT为核心序列的位点各有5个，这4种核心序列在筛选出的58个SSR位点中占41.38%，其余重复单元位点个数均小于5个位点。

2.3 菲律宾蛤仔野生群体遗传多样性分析

根据40对SSR引物在32个个体中扩增片段的分布情况进行统计，得出等位基因数(Na)在2—6之间，平均等位基因数为3.4250±0.9718，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别在0.000—1.000和0.0615—0.7996之间，平均值分别为0.2727±0.2272和0.4739 ± 0.1902。群体平均Nei指数为0.4664±0.1872，遗传多样性指数为平均Shannon指数为0.8330±0.3445。多态信息含量(PIC)在0.0586—0.7529范围内，平均值为0.4148±0.1707，其中16个SSR位点的PIC值均大于0.5，15个位点的PIC值在0.25—0.5之间,9个位点的PIC值小于0.25。χ2检验Hardy-Weinberg平衡结果表明，有29个位点极显著的偏离(P<0.01)，2个位点显著偏离(P< 0.05)，9个位点表现为符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(表2)，经Sequential Bonferroni校正后，除Rpt23、Rpt83、Rpt111、Rpt161、Rpt163、Rpt177、Rpt188、Rpt219、Rpt254、Rpt261 10个位点，其余位点均偏离平衡。

图1 部分引物的扩增结果Fig.1 The amplification results of some microsatellite loci

3 讨论

目前，菲律宾蛤仔微卫星开发技术比较单一，且开发数量有限。如N. YASUDA[15]等人利用双重抑制PCR技术从菲律宾蛤仔(R.philippinarum)中分离出22对微卫星引物，共有9对引物成功扩增出特异条带，可用于蛤仔的微卫星DNA标记。Hye Suck An[16]等人利用预杂交PCR扩增技术(prehybridization PCR amplification)得到13个微卫星标记位点并对杂色蛤进行跨物种扩增，得到9对引物在菲律宾蛤仔(R.philippinarum)中有多态性，8对引物在杂色蛤(R.variegate)中呈现多态性。闫喜武[13]等人通过搜索NCBI中EST文库，获得5658个EST序列，筛选出13个蛤仔SSR序列，利用筛选出的13个SSR序列对蛤仔3个地理群体的遗传多样性进行研究分析，虞志飞[14]等人用上述SSR位点，对大连群体不同年龄阶段的蛤仔进行遗传多样性分析，结果表明年龄结构对蛤仔种群内遗传分化的影响较小。随着蛤仔大规模养殖及育种工作的广泛开展，仅有上述的微卫星标记还远远不够。转录组平台的构建，在很大程度上推动了DNA分子标记的开发。近年来利用转录组数据获得含有微卫星的序列，并对其进行遗传多样性的研究在国际上已有成功报道[17- 19]。如2012年Hye Suck An[20]等人利用454测序系统筛选出22个厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)SSR位点并对其进行多态性分析；同年其同样利用第二代测序技术在太平洋鲍鱼(Haliotisdiversicolorsupertexta)中挑选出20个有多态座位的SSR标记位点[21]。可见该方法已成功应用于大规模筛选贝类微卫星标记位点。本文首次在蛤仔中利用转录组测序数据批量筛选SSR位点，筛选出具有清晰扩增条带的58个微卫星位点，其中40个呈现出不同程度的多态性。相比之下该方法筛选效率高，工作量相对较小，且适合大规模开发微卫星标记位点，且开发位点可能与功能基因相关，可为后续遗传图谱构建，QTL定位等提供有力支持。

遗传多样性可用于衡量生物遗传信息变异的程度，DNA则是遗传信息的主要载体，所以DNA的多样性能够直接反映物种遗传变异程度。群体的遗传多样性主要表现在等位基因数、杂合度和多态信息含量3个方面[22]。本研究中，对基于转录组平台得到的145个微卫星位点进行引物筛选，并在大连庄河野生蛤仔群体中研究其多样性，发现58个位点可以扩增出清晰条带，其中18个位点表现为单态性，暂不计于遗传多样性分析，另40个位点则表现出不同程度的多态性，用于遗传多样性分析。得到Na= 2—6(平均值3.4250±0.9718)，Ho= 0.000—1.000(平均值0.2727±0.2272)，He= 0.0615—0.7996(平均值0.4739±0.1902)，PIC= 0.0586—0.7529(平均值0.4148±0.1707)，根据多态信息含量指标，共有16个微卫星位点表现为高度多态性(PIC≥ 0.5),15个位点为中度多态性(0.25 ≤ PIC<0.5)，9个位点为低度多态性(PIC<0.25)，且PIC平均值也接近于0.5，可见庄河野生蛤仔维持着较好的多样性，能够为蛤仔的群体结构和其他遗传研究做理论指导。与其他人研究结果相比，Hye Suck An[16]等人研究结果为Na= 9—26，He= 0.73—0.94，N. YASUDA[15]等人研究得Na= 6—22,Ho= 0.136—0.909，He= 0.553—0.954，本实验结果均略低于以上研究数据，究其原因，作者认为可能由于微卫星位点不同、个体间差异、生长环境迥异等非确定性因素，导致实验结果与他人结果存在一定偏差，但本研究结果与闫喜武[13]2011年报道的大连野生群体Na= 3—5，Ho= 0.10—0.97，He= 0.51—0.72的结果相比差别不大，可能是由于该研究与本文中群体都来源于大连庄河，且微卫星标记均来自于EST数据有关。

表2 32个野生蛤仔中的40个微卫星位点的特征描述Table2 Characterization of 58 microsatellite loci in 32 wild clam

续表

Tm退火温度: annealing temperature；Na等位基因数: Allele number；Ho观测杂合度: observed heterozygosity；He期望杂合度: expected heterozygosity；PIC多态信息含量: polymorphism information content；H香农一威纳指数: Shannon-Wiener Index；Phew: 哈德-温格平衡χ2检验Chi-squaretestforHardy-Weinbergequilibrium

另外统计得到以TTG为核心序列的位点有8个，以TGG为核心序列的位点有6个，分别以TGT和ATC为核心序列的位点各有5个(表2)，这4种核心序列在筛选出的58个SSR位点中占41.38%，在三碱基重复序列中，TTG、TGG、TGT、ATC为相对丰富的拷贝类别，且具有相对高的多态性，这为后续重复序列的筛选以及进一步了解蛤仔基因组特性提供了参考。随着转录组平台的进一步深入分析，更多与功能基因相关的微卫星位点将被发掘出来，这将为蛤仔人工标记辅助育种提供更多的分子标记，并为蛤仔生长、抗病力、肉质等重要经济性状相关标记的筛选和定位奠定必要的基础。

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Development of microsatellite markers inRuditapesphilippinarumusing next-generation sequencing

YAN Lulu, QIN Yanjie, YAN Xiwu*, WANG Linnan, BI Chenglong, ZHANG Jinyuan

EngineeringResearchCenterofShellfishCultureandBreedinginLiaoningProvince,CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian, 116023,China

Ruditapesphilippinarumhas a high growth rate, short culture cycle, and is highly adaptable. Because of these traits, it is one of China′s four major cultured shellfishes, and one of the world′s major cultured shellfishes. Microsatellites known as simple sequence repeats are widely used to assess genetic diversity in farmed aquatic species populations, construct molecular genetic maps, and carry out gynogenesis, gene mapping, gene cloning, and paternity tests. These molecular markers have high stability and polymorphism, are site-specific and easily detected, and exhibit codominant inheritance and transferability of SSR primers. At present, the sustainable culture ofRuditapesphilippinarumis threatened by having a single breeding method and difficulties with disease prevention, control, and treatment. We developed a series of microsatellite markers using a transcriptome-based platform to provide a foundation for genetic research inRuditapesphilippinarum. These markers may also be used for Ruditapes marker-assisted breeding. Genetic diversity measures the degree of variability of biological genetic information. DNA is the primary carrier of genetic information, so the diversity of DNA directly reflects the degree of genetic variation. The genetic diversity of a population can be represented by the number of alleles, heterozygosity scores, and polymorphism information content (PIC). We sequenced a large number of ESTs and screened 145 potential microsatellites of trinucleotide repeats using MISA software. We successfully obtained clear, reproducible bands for 58 microsatellite loci. These were amplified in 32 wild clam individuals sampled from Zhuanghe, Dalian, Liaoning. A single allele was detected at 18 loci and another 40 were polymorphic (number of alleles per locus ranged from 2 to 6, with an average of 3.4250±0.9718). The observed and expected heterozygosity was 0.000—1.000 (0.2727±0.2272) and 0.0615—0.7996 (0.4739±0.1902), respectively. The average of the Nei index was 0.4664±0.1872. The polymorphism information content (PIC) of all loci ranged from 0.0586 to 0.7529 (0.4148±0.1707). Among these, 16 loci had a PIC of >0.5, so were classified as highly polymorphic. An additional 15 loci were moderately polymorphic withPICsranging from 0.25 to 0.5. The PIC of 9 loci was <0.25, meaning that these were classified as low polymorphic loci. Using a test of the Hardy-Weinberg principle (χ2test) and sequential Bonferroni calibration, all except 10 loci had deviated equilibrium. Eight loci had a core sequence of TTG, 6 had a core sequence of TGG, and 5 each had a core sequence of TGT or ATC. These four core sequences accounted for 41.38% of the 58 SSR screened loci. Based on this, we infer that TTG, TGG, TGT, and ATC are relatively abundant copy categories of the trinucleotide repeat sequences. Our results provide a reference for subsequent repetitive sequence screening and further understanding the characteristics of the Ruditapes genome. Microsatellite marker development by transcriptome sequencing proved to be efficient and feasible inR.philippinarum. Further in-depth analysis based on transcriptome analysis will likely yield more microsatellite sites which are associated with functional genes, thereby providing more molecular markers for Ruditapes artificial marker-assisted breeding. These polymorphic markers may also be used in future studies of population genetics, linkage mapping and assisted breeding inR.philippinarum.

Ruditapesphilippinarum; transcriptome sequencing; microsatellite markers; genetic diversity

国家863计划(2012AA10A410- 2); 现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS- 48)

2013- 05- 15;

日期:2014- 04- 17

10.5846/stxb201305151071

*通讯作者Corresponding author.E-mail: yanxiwu2002@163.com

闫路路，秦艳杰，闫喜武，王琳楠，毕成隆，张津源.基于转录组平台的蛤仔微卫星标记筛选.生态学报,2015,35(5):1573- 1580.

Yan L L, Qin Y J, Yan X W, Wang L N, Bi C L, Zhang J Y.Development of microsatellite markers inRuditapesphilippinarumusing next-generation sequencing.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1573- 1580.