淋巴细胞免疫分型对间质性肺病变的临床分析

刘培培，姜悦垚，侯松萍*

(1．吉林大学中日联谊医院 呼吸内科，吉林 长春130033；2．吉林大学药学院，吉林 长春130021)

淋巴细胞免疫分型对间质性肺病变的临床分析

刘培培1，姜悦垚2，侯松萍1*

(1．吉林大学中日联谊医院 呼吸内科，吉林 长春130033；2．吉林大学药学院，吉林 长春130021)

摘要：目的探讨外周血淋巴细胞免疫分型及NK细胞水平变化对于间质性肺病变的原因是结缔组织疾病所致，还是其它原因所致的临床价值。方法50例间质性肺病变患者，分结缔组织疾病组、非结缔组织疾病组，每组25例；正常对照组25例，采用流式细胞术检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+NK细胞、CD19+B淋巴细胞表达水平，比较三组间的外周血淋巴细胞各亚群的差异。结果结缔组织疾病组与非结缔组织疾病组相比，CD8+T细胞明显增高(P<0.01);结缔组织疾病组与正常对照组相比，CD8+T细胞也明显增高,但CD56+数明显降低,均P<0.05;非结缔组织疾病组与正常对照组相比，外周血T 细胞各亚群均无明显差异。结论结缔组织疾病组外周血CD8+T细胞明显增高、NK细胞数明显降低；非结缔组织疾病组外周血T 细胞各亚群未见明显异常，提示外周血淋巴细胞免疫分型有助于识别免疫性损伤引起的结缔组织疾病并发间质性肺病变。

关键词：结缔组织疾病；非结缔组织疾病；间质性肺病；淋巴细胞亚群；NK细胞

(ChinJLabDiagn,2015,19:2066)

弥漫性间质肺疾病(DILD)是一组临床特征相似，免疫病理过程各异的众多肺疾病组成的疾病谱，病因不明者占65%，其发病机制至今尚未完全清楚[1]。病毒、细菌、真菌、吸入有害气体、药物、风湿病等均可导致间质性肺病。ILD涵盖许多疾病,各有其临床特点,诊断有其难处,治疗和预后又因诊断而异[2]。本文通过检测结缔组织疾病患者、非结缔组织疾病患者和正常人的外周血淋巴细胞免疫分型，探讨其对于间质性肺病变的原因是免疫损伤，还是非免疫损伤所致提供理论依据。

1材料与方法

1.1临床资料选取吉林大学中日联谊医院于2012年5月至2014年5月期间收治的50间质性肺病变患者。其中25例结缔组织疾病并发间质性肺病变患者，诊断按2012年风湿病新版全套指南标准[3]，年龄24-80岁，平均 54.2±16.8 岁,其中男11例，女14例，结缔组织疾病组病种构成为：类风湿关节炎7例，多发性肌炎7例， 皮肌炎4例，干燥综合征4例，系统性红斑狼疮3例。25例非结缔组织疾病并发间质性肺病变患者，年龄26-80岁，平均 57.8±15.5 岁,其中男10例，女15例。非结缔组织疾病组病种构成为：继发于感染5例，药物性 3例，胃食管反流 3例，原因不明 14例。两组患者胸部CT影像主要表现：两肺弥漫性分布的磨玻璃影、网状阴影，有时可见牵引性支气管扩张。另选取25例健康人作为正常对照组，年龄30-77岁，平均 52.2±15.7 岁，其中男13例，女性12例。结缔组织疾病组3例、非结缔组织疾病组2例患者采取淋巴细胞免疫分型血液标本前使用激素，其余患者及健康对照组均未使用糖皮质激素。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- PC5(货号：6607013)；细胞裂解液：OptiLyse○RNO-lysing Solution(货号：A11894)；流式细胞仪：Beckman Coulter FC500；以上所有试剂均购自美国Beckmen Coulter公司。

1.2.2血液样本制备采集患者及正常健康人外周血2 ml，加入到EDTA抗凝的真空管中，混匀。取三只流式细胞仪上样管，分别命名为同型对照管和实验管1和实验管2，每管中均加入100 μl抗凝全血，然后分别加入?20μl同型对照抗体和CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5抗体和CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5，充分混匀，避光室温孵育15 min；然后向每管中加入红细胞裂解液500 μl，充分混匀，避光孵育10 min后加入500 μl PBS，1000 r/min离心5 min，弃上清，每管加入500 μl鞘液，混匀，等待上机检测。

1.2.3指标测定外周血淋巴细胞亚群及NK细胞检测均采用流式细胞检测技术，由我院中心实验室专人操作检测。

2结果

外周血T细胞各亚群检测结果：结缔组织疾病组与非结缔组织疾病组相比，CD8+T细胞明显增高(P<0.01);结缔组织疾病组与正常对照组相比，CD8+T细胞也明显增高,但CD56+数明显降低,均P<0.05;非结缔组织疾病组与正常对照组相比，外周血T细胞各亚群均无明显差异。见表1。

表1　各组外周血淋巴细胞免疫分型结果比较±s)

注:与非结缔组织疾病组比较，ΔP<0.05;与正常对照组比较，*P<0.05

3讨论

急性间质性肺疾病或发作性间质性肺疾病病情进展迅速，死亡率高，短期内出现呼吸功能衰竭，做支气管-肺泡灌洗液方面的检查，病人及家属难以接受，医疗风险也很大。尤其结缔组织病患者出现急性间质性肺病变时,很难判断是长期用激素或免疫抑制剂治疗，合并了真菌、病毒感染；还是这类病人免疫功能异常用药及饮食等因素出现过敏反应造成急性肺损伤，或是结缔组织病急性活动期造成双肺间质弥漫性病变，临床上很难甄别这些情况。为了挽救病人生命，临床上经常给予大剂量激素和抗真菌、抗细菌、抗病毒治疗，由于治疗用药没有准确的目标，不但造成治疗费用高，而且还易出现各种药物的不良反应，治疗效果也很差。为提高对间质性肺病变患者的机体免疫状态评估能力及免疫损伤是否参与患者肺间质病变炎症反应过程的识别能力，本文对结缔组织疾病组、非结缔组织疾病组与健康人的外周血淋巴细胞免疫分型结果进行比较，研究结果显示结缔组织疾病组与非结缔组织疾病组相比，CD8+T细胞明显增高(P<0.01)，结缔组织疾病组与正常对照组相比，CD8+T细胞也明显增高(P<0.05)，非结缔组织病组与正常对照组相比，CD8+T细胞无统计学差异。杨亚敏等研究结果显示：高活动期系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD8+细胞百分率较稳定期明显升高(P<0.01)；李昕等研究结果显示：原发干燥综合征患者外周血CD8+T 淋巴细胞水平明显高于正常对照组(P<0.05) 和SLE 组(P<0.05),SLE 组外周血CD8+T 淋巴细胞水平也高于正常对照组(P<0.05)，CD8+细胞水平在疾病活动期明显升高 。这两项研究结果均提示结缔组织疾病活动期外周血CD8+细胞水平明显增高。本文结果表明结缔组织疾病组合并间质性肺病变时，体内发生明显的免疫功能紊乱，CD8+T细胞活化，提示CD8+T细胞在结缔组织疾病肺免疫损伤过程中发挥重要的作用。因此，结缔组织疾病合并间质性肺病变时，T淋巴细胞亚群的数量及功能改变可提示机体免疫功能异常，如果能在这个阶段对机体的免疫学异常进行干预，则对改善结缔组织疾病和肺部病变的治疗效果和预后极其有利。

CD56分子是自然杀伤细胞 (NK细胞)表面主要的表面标记，NK细胞不仅是机体内的第一道免疫防御屏障，而且也具有免疫调节能力，NK细胞对T、B淋巴细胞、骨髓干细胞具有调控作用(免疫自稳)。本文研究结果显示结缔组织疾病组NK细胞数量明显低于正常对照组，邹原方等研究结果显示SLE患者外周血CD3+CD56+自然杀伤T细胞的表达水平明显低于正常对照组，该结果与本文一致[4]。Berzofsky等认为，NKT细胞是一种负向免疫调节细胞，能够通过分泌IL-4 等细胞因子抑制免疫应答[5];Wermeling等研究结果显示：在系统性红斑狼疮患者体内，iNKT细胞可以有效清除凋亡小体，进而抑制 CD1d+ 自身反应性 B淋巴细胞的激活[6],本文研究结果NK细胞数量下降是否提示结缔组织疾病组机体B淋巴细胞产生自身抗体，是由于NK细胞数量下降，对T、B淋巴细胞调控作用减弱所致，还需进一步研究证实。

非结缔组织疾病组与正常对照组相比，外周血T 细胞各亚群无明显差异，提示不一定需要激素或免疫抑制剂控制炎症反应，更应该积极寻找肺间质病变的原因，去除致病因素，给予相应治疗。

总之，间质性肺病变患者的外周血T 细胞各亚群的变化令人关注,尤其是哪些间质性肺病变的重症患者、临床上难以实施支气管-肺泡灌洗液方面的检查，值得扩大样本量进一步研究，以揭示外周血T淋巴细胞亚群检测在弥漫性间质性肺疾病甄别肺损伤是否免疫损伤所致的作用，为指导治疗方向提供实验室依据。

参考文献：

[1]李振华.支气管-肺泡灌洗液检查在弥漫性间质性肺疾病中的应用[J].现代实用医学，2013，25(1)：2.

[2]朱元珏.间质性肺疾病的诊断和治疗进展[J].临床肺科杂志,2007，12(1)：1.

[3]中华医学会风湿病学分会.风湿病新版全套指南.2012年2月18日修改版.

[4]邹原方，罗婉莹，郭少卿,等.系统性红斑狼疮患者外周血CD3+CD56+自然杀伤T细胞的表达及临床意义[J].国际检验医学杂志,2014,35(8):967.

[5]Berzofsky JA，Terabe M．NKT cells in tumor immunity：opposing subsets define a new immunoregulatory axis[J]．J lmmunol，2008，180(6)：3627．

[6]Wermeling F，Lind SM，Jordo ED，et al．Invafiant NKT cells limit activation of autoreactive CDld-positive B cells[J]．J Exp Med，2010，207(5)：943．

The clinical analysis of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping in interstitial lung lesionsLIUPei-pei1，JIANGYue-yao2，HOUSong-ping1*.(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,China-JapanUnionHospital,JiLinUniversity,Changchun130033,China；2.CollegeofPharmacy，JiLinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical value of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping and CD56+NK cell levels in interstitial lung disease due to connective tissue diseases or other causes.Methods50 patients with interstitial lung lesions，divided into connective tissue disease group，non-connective tissue disease group， 25 cases in each group.25 cases of healthy as the normal control.The levels ofCD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in the three groups were determined by a flow cytometry；compared differences between three groups of peripheral blood lymphocyte subsets.ResultsCompared with the non-connective tissue disease group，the levels of CD8+ cells in the connective tissue disease group were significantly higher (P<0.01);compared with the normal control group,the levels of CD8+ cells were also significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group(both P<0.05)；compared with the normal control group,the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious changes(P>0.05).ConclusionThe levels of CD8+cells in peripheral blood were significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group；the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious abnormal.It prompted that peripheral blood lymphocyte immunophenotyping helps to identify immune injury of the connective tissue disease complicated with interstitial lung disease.

Key words:Connective tissue disease;Non-connective tissue disease;Interstitial lung diseases;Lymphocyte subsets;NK cell

(收稿日期：2015-01-12)

文献标识码：A

中图分类号：R563.1

文章编号：1007-4287(2015)12-2066-03

*通讯作者