苎麻水解液中单糖类组分的柱前衍生-高效液相色谱法检测

冯湘沅，成莉凤，段盛文，谭志坚，郑 科，刘正初

(中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

苎麻纤维是我国的重要纺织原料［1］，其纤维化学成分主要为纤维素，同时含有半纤维素、果胶、木质素等伴生物，这些物质在适当条件水解后，变成甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖等单糖类组分，而各单糖类组分含量是最重要的基础数据之一［2－3］。目前，对苎麻组成成分的分析方法仅限于单一法［4－5］，本文结合柱前衍生技术，探讨了高效液相色谱法快速、准确地分离、鉴定与检测苎麻水解产物中的单糖类组分及含量［6－8］，旨在为苎麻等草本植物纤维综合开发利用研究［9］提供科学参考。

1 试验部分

1.1 试验材料与主要仪器

样品1:湖南沅江基地种植的湘苎2号苎麻原麻。

样品2:湖南长沙基地种植的圆青5号苎麻原麻。

试剂:乙腈(色谱纯)、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖均为美国Sigma公司产品，醋酸铵(分析纯)、1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸均为国药集团化学试剂有限公司产品。

Dionex Ultimate 3000液相色谱仪，LPG-3400泵，VWD-3400紫外检测器、Thermo Hypersil BDS C18 柱(250mm ×4.6mm，5 μm)，数据采集和图谱处理采用变色龙软件。

1.2 色谱条件

色谱柱:C18柱，紫外检测器;柱温为35℃;流动相V(0.1 mol/L醋酸铵缓冲溶液，pH值为5.5)∶V(乙腈)=81∶19;流速为 1.0 mL/min;波长为250 nm;进样量为 20 μL。

1.3 苎麻水解

称取苎麻样品20 mg剪碎置于具塞试管中，加入三氟乙酸，于 110℃水解 3 h，冷却至室温，3000 r/min离心10 min，取水解产物上清液真空干燥。

1.4 单糖类衍生化

混合标准单糖类溶液配制:分别称取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖各18 mg，混合6种单糖类溶于7.5 mL浓度为0.3 moL/L的NaOH溶液中。

单糖类衍生:取75 μL混合标准单糖类溶液与50 μL PMP甲醇(0.5 mol/L)混合，70℃条件下反应30 min，冷却至室温，用75 μL浓度为0.3 mol/L的HCl中和，置真空干燥箱中干燥。加1 mL去离子水和1 mL三氯甲烷完全溶解干燥固形物，去除有机相(重复此步骤3次)。水相用0.45 μm滤膜过滤后，加去离子水稀释至5 mL，进行高效液相色谱分析［10－11］。混合标准单糖类溶液使用时稀释成所需浓度。

苎麻水解产物上清液经真空干燥后的固形物单糖类衍生方法同混合标准单糖类衍生方法。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

为使苎麻水解液中的单糖类有效分离，本文实验分别采用甲醇与水、乙腈与水、K2HPO4-NaOH与乙腈以及醋酸铵缓冲溶液与乙腈作为流动相，通过多次不同配比选择比较，当V(醋酸铵缓冲溶液)∶V(乙腈)=81∶19时分离效果最佳，各单糖类均获得较好分离。利用该流动相分离的混合标准单糖类溶液色谱图如图1所示。

图1 混合标准单糖类溶液色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.2 标准曲线绘制

将混合标准单糖类溶液分别稀释 2、4、6、8、10倍进样分析，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，其各组分的线性回归方程、相关系数、线性范围见表1。结果表明，各单糖的线性相关系数为0.9996～0.9999，线性关系良好。

2.3 方法精密度试验

取稀释4倍的混合标准单糖类溶液重复进样6次，测定仪器和方法的精密度，结果见表2。表中结果显示，各单糖的相对标准偏差均在2.02%以下，说明本方法满足精密度要求。

表1 6种单糖类线性回归方程、相关系数及线性范围Tab.1 Linear regression equation，relative coefficient and linearity range of six monosaccharides

表2 混合标准单糖类溶液测定精密度Tab.2 Precision of mixed standard monosaccharides

2.4 加样回收率试验

取已知含量的样品溶液，加入适量标准单糖类溶液，混匀，进样分析，计算回收率，见表3。表中结果表明，6种单糖类的回收率为96.53% ～102.76%，符合仪器分析要求(95% ～105%)。同时，也说明使用该方法处理苎麻样品，其单糖类含量损失少，误差小。

表3 6种单糖类组分的回收率Tab.3 Recoveries for 6 standard monosaccharides

2.5 样品含量的测定

取2个供试苎麻样品各20 mg，通过三氟乙酸水解后，水解产物上清液干燥衍生化处理，滤渣干燥称量，结果见表4。由表可知，经三氟乙酸处理，苎麻水解率可达90%，未被三氟乙酸水解的木质素等酸不溶性物质在10%以下，说明采用三氟乙酸水解苎麻的纤维素、半纤维素与果胶等生成单糖类物质是可行的。

表4 苎麻水解率测定结果Tab.4 Hydrolysis ratio for ramie

对供试苎麻样品进行分离检测，苎麻水解液单糖类组分色谱图见图2。根据混合标准单糖类溶液色谱图及绘制标准曲线的各组分回归方程计算，获得苎麻水解产物的单糖类衍生物的含量见表5。结果表明，苎麻中的主要单糖类组分为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖，其中葡萄糖含量最高，占样品1被水解已知单糖类物质总量(801.75 μg)的83.86%，占样品2已知单糖类物质总量(679.12 μg)的86.54%。另外，还有占水解产物总量的少量未知组分。

图2 苎麻水解液单糖类组分色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of monosaccharides in hydrolyzed ramie

表5 苎麻水解液单糖类含量测定结果Tab.5 Monosaccharides content of hydrolysed ramie

3 结论

本文研究利用柱前衍生-高效液相色谱法对苎麻水解产物中的单糖类组分进行了分析，检测结果表明，采用三氟乙酸处理，能达到水解苎麻中纤维素、半纤维素及果胶等生成多种单糖物质的目的。苎麻水解液中的主要单糖类组分为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖，其中，葡萄糖含量最高，在样品 1为 672.32 μg，样品 2中为587.74 μg，而甘露糖最低。通过样品 PMP柱前衍生，实现了利用C18柱和紫外检测器对苎麻水解液中单糖类组分的检测，该方法具有线性关系良好、精密度高、回收率好等优点。另外，存在的未知组分有待于进一步分析。

［1］熊和平.苎麻多功能开发潜力及利用途径［J］.中国麻作，2001，23(1):22 －25.XIONG Heping.The first of serial reports on multifunctional development and utilization in ramie-Thepotential with multi-functional development and the path of utilization in ramie［J］.China's Fiber Crops，2001，23(1):22 －25.

［2］冷鹃，程毅，肖爱平，等.苎麻化学成分微波快速测定［J］.中国麻业科学，2009，31(3):211－214.LENG Juan， CHENG Yi， XIAO Aiping， etal.Determine ramie chemical components by microwave rapid test method［J］.Plant Fiber Sciences in China，2009，31(3):211 －214.

［3］王成国，谭远友，张尚勇.苎麻化学成分动态变化规律研究［J］.上海纺织科技，2008，36(1):15－19.WANG Chengguo，TAN Yuanyou，ZHANG Shangyong.Study on dynamic change regulation of ramie's chemical composition［J］. Shanghai Textile Science ＆Technology，2008，36(1):15 －19.

［4］张宏书，杨精千，蔡楚森.苎麻葡甘聚糖的提纯和分析［J］.纤维素科学与技术，2002，10(1):1－7.ZHANG Hongshu，YANG Jingqian，CAI Chusen.The purification and analysis of ramie glucomanna［J］.Journal of Cellulose Science and Technology，2002，10(1):1－7.

［5］姜伟，韩光亭，张元明，等.基于近红外技术的苎麻纤维素及胶质含量快速测定［J］.纺织学报，2012，33(1):6－10.JIANG Wei，HAN Guangting，ZHANG Yuanming，et al.Fast quantitative analysis of cellulose and gum content in ramie based on near-infrared technique［J］.Journal of Textile Research，2012，33(1):6 －10.

［6］周红，杨祥良，张晓昱，等.半纤维素菌株发酵液中单糖及二糖的分析［J］.武汉化工学院学报，2002，24(4):17－19.ZHOU Hong，YANG Xiangliang，ZHANG Xiaoyu，et al.Analysis of mono-sacchrides and di-saccharides in semi-fiber fermentation liquor by high pressure liquid chromatography［J］.Journal of Wuhan Institute of Chemical Technology，2002，24(4):17 －19.

［7］方宏，曾健智，陈海珊，等.高效液相色谱法检测蔗糖半纤维素水解物中的单糖［J］.广西科学院学报，2000，16(3):124 －126.FANG Hong，ZENG Jianzhi，CHEN Haishan，et al.Analysis of monosaccharide compositions of semi-fiber cellilose by HPLC Method［J］.Journal of Guangxi Academy of Sciences，2000，16(3):124 －126.

［8］范刚，唐策，李艳，等.柱前衍生HPLC分析黄连多糖的单糖组成［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(11):74－78.FAN Gang，TANG Ce，LI Yan，et al.Analysis of monosaccharide compositions of polysaccharides in coptidis rhizoma by pre-column derivatization HPLC method［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2014，20(11):74 －78.

［9］刘正初.用科学发展观看我国草本纤维产业前景［J］.中国麻业科学，2007，29(增刊):68－71.LIU Zhengchu.Foreground analysis of herbaceous fiber industry with scientific development view in China［J］.Plant Fiber Sciences in China，2007，29(supplement):68－71.

［10］林雪，贾敬芬，黄琳娟，等.RP-HPLC用于芦荟多糖的单糖组成研究［J］.食品科学，2006，27(4):192－195.LIN Xue，JIA Jingfen，HUANG Linjuan，et al.Study on the use of RP-HPLC in analysis of aloe polysaccharide composition［J］.Food Science，2006，27(4):192－195.

［11］姜彩霞，刘晓兰，田英华，等.高效液相色谱法测定亚麻纤维果胶单糖衍生条件的优化［J］.毛纺科技，2014，42(10):1 －4.JIANG Caixia，LIU Xiaolan，TIAN Yinghua，et al.Optimization for precolumn derivatization of monosaccharide in flax fiber pectin by HPLC［J］.Wool Textile Journal，2014，42(10):1 －4.