微乳法制备姜黄素固体脂质纳米粒Δ

李 楠，李锡晶，王 倩（天津市医药科学研究所，天津 300020）

研究表明，传统中药姜黄中的主要活性成分姜黄素（Curcumin，Cur）抑制肿瘤细胞生长的效果显著、抗癌谱广、毒副作用小，是一种具有良好应用前景的抗癌新药，但因其水溶性极差、口服生物利用度低，限制了其在临床上的应用[1-2]。

固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一种可替代聚合物纳米粒和脂质体的新型胶体给药系统，既具备物理稳定性高、药物不易泄露的优势，又兼具了低毒、缓控释、靶向、提高生物利用度、耐受性好等优点[3]。微乳一般呈透明或半透明状，粒径在100 nm以内，通常由油、水、乳化剂和助乳化剂4种成分组成。本研究以微乳法制备固体脂质纳米粒，将Cur包裹于固体脂质纳米粒内，以提高Cur稳定性并改善其水溶性。先采用单因素试验进行初步筛选，再采用正交试验法优选确定，得出微乳法制备Cur-SLN的优化工艺，并验证其重现性。结果证明，建立的方法操作简便、可行，为开发Cur给药新剂型提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

Spectrum-754型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；UV-2450型紫外扫描检测仪（日本Shimadzu公司）；Zetasize粒度及Zeta电位分析仪（英国Malvern公司）；XW-80A型涡旋混合仪（上海医科大学仪器厂）；RE-5285A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；90-2型定时恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂）；超纯水机（德国Pall公司）。

1.2 药品与试剂

Cur对照品（南京泽朗医药科技有限公司，批号：20140226，纯度：99.0%）；Cur原料药（天津一方科技有限公司，批号：20130312，供含量测定用）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40，德国Basf公司，批号：20120620）；大豆卵磷脂（以下简称磷脂，批号：20120523）、聚乙二醇400（PEG-400，批号：20120811）均购自天津市光复精细化工研究所；泊洛沙姆188（F68，南京威尔化工有限公司，批号：20130108）；葡聚糖凝胶G-50（上海蓝季科技有限公司，批号：131118）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 影响空白微乳形成的因素考察

伪三元相图是进行微乳处方筛选的重要依据，对微乳形成所需的三相因素进行考察，得出微乳制备的最优条件[4-5]。

2.1.1 不同乳化剂的微乳相图绘制 采用乳化剂/乙醇/硬脂酸/水系统，选择聚山梨酯80、RH40、磷脂及F68作为乳化剂，65 ℃下制备伪三元相图。

图1 不同乳化剂对微乳伪三元相图的影响（Km＝1 ∶4，温度：65 ℃）Fig 1 Effects of different emulsifiers on the pseudo-ternary phase diagram of microemulsion（Km＝1∶4，T＝65 ℃）

由图1可见，RH40为乳化剂时所形成的微乳区域最大，但在室温下不稳定，由其制备的SLN粒径较大、体系不稳定；聚山梨酯80为乳化剂时形成的微乳区域较大，且室温下稳定，制备的SLN粒径较小，放置9个月以上体系仍稳定。故选择微乳的乳化剂为聚山梨酯80。

2.1.2 助乳化剂对微乳形成的影响 采用聚山梨酯80/助乳化剂/硬脂酸/水系统，分别选择乙醇、PEG-400、异丙醇和1，2-丙二醇作为助乳化剂，Km＝1∶4，65 ℃下制备伪三元相图，见图2。由图2可知，乙醇作助乳化剂时，微乳透光性与流动性很好，且有明显的淡蓝色乳光，4 ℃放置9个月以上仍能保持稳定；异丙醇作助乳化剂时的微乳形成区域较乙醇小，且放置10 d后稳定性下降，有沉降物出现；1，2-丙二醇和PEG-400作助乳化剂时，微乳形成区域较异丙醇更小，且由于本身有较大的黏度，所形成的微乳流动性不如乙醇与异丙醇。故选择乙醇为制备微乳的助乳化剂。

图2 不同助乳化剂对微乳伪三元相图的影响（Km＝1 ∶4，温度：65 ℃）Fig 2 Effects of different co-emulsifiers on the pseudo-ternary phase diagram of microemulsion（Km＝1 ∶4，T＝65 ℃）

2.1.3 不同Km值的影响 以Km为1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5和1 ∶6的比例配成不同的聚山梨酯80/乙醇溶液，65 ℃下绘制相图。结果，随着Km减小，微乳区域面积减小，表明乳化剂用量大有利于微乳的形成。助乳化剂可以调节乳化剂的亲水亲油平衡值，使与相应的油相适应，形成稳定的微乳。各比例下都可用水无限稀释至顶点。当Km＝1 ∶4时，微乳的形成区域最大，且微乳稳定性最好，故确定此Km值制备微乳。

2.2 葡聚糖凝胶柱层析测定Cur-SLN包封率方法的建立

2.2.1 层析柱洗脱曲线的绘制 采用葡聚糖凝胶柱法，取葡聚糖凝胶G-50适量，装柱，柱床高22 cm。分别取空白SLN混悬液和Cur的甲醇饱和溶液各0.5 ml上柱，以蒸馏水为洗脱液进行洗脱，流速控制在1 ml/min，每5 ml收集1试管（共收集20管），422 nm波长处测定吸光度，绘制洗脱曲线。结果表明，空白SLN与游离Cur实现良好分离，且洗脱峰形良好，游离Cur在40～65 ml洗脱液中，详见图3。

图3 洗脱曲线（22 cm）Fig 3 Elution curve（22 cm）

2.2.2 柱回收率的考察 制备低、中、高3种不同质量浓度的Cur甲醇标准溶液，分别取0.5 ml上样，收集40～65 ml段溶液，测定并计算回收率。结果平均柱回收率为102.56%、100.61%、100.52%，RSD分别为0.55%、0.53%、1.07%（n＝3）。

2.2.3 加样回收率的考察 用SLN混悬液配制Cur低、中、高3种不同质量浓度的混合液，分别取0.5 ml上样，收集40～65 ml段溶液，测定并计算回收率。结果平均加样回收率分别为98.15%、99.10%、99.12%，RSD分别为0.74%、0.12%、0.20%（n＝3），回收率能满足定量要求。

用“%”的形式,表示2组治疗效果、不良反应发生情况,并用卡方值检验,在用SPSS20.0软件核对后,当2组社区糖尿病患者的各指标数据有差别时,用P<0.05表示。

2.2.4 Cur-SLN混悬液包封率测定方法（1）游离药物含量的测定：吸取Cur-SLN混悬液0.5 ml上柱，用蒸馏水洗脱，精密收集40～65 ml段溶液，混匀，甲醇定容至100 ml，测定并计算游离药物的含量。（2）总药物含量的测定：吸取Cur-SLN混悬液0.5 ml，用甲醇定容至10 ml，再吸取1 ml用甲醇稀释至25 ml，测定并计算总药物的含量。根据包封率（EE）公式（见“2.5.1”项）计算EE。

2.3 Cur-SLN中Cur的紫外分光光度法测定

将Cur对照品和空白SLN分别用甲醇稀释定容后，在200～700 nm范围内进行全波长扫描。结果Cur在422 nm波长处有最大吸收峰，而此处空白SLN几乎无吸收，表明紫外分光光度法对姜黄素特异性良好，因此可确定422 nm波长为测定波长。以吸光度（y）与质量浓度（x）进行回归得线性方程为y＝0.142 3x+0.013 4（r＝0.999 6），Cur检测质量浓度线性范围为1～11 μg/ml，相关方法学考察均符合要求。

2.4 微乳法制备载药SLN的工艺[7]

称取处方量的Cur、硬脂酸，65 ℃熔化，加适量相同温度的Km＝1 ∶4的聚山梨酯80/乙醇溶液及适量蒸馏水，涡旋1 min即可形成O/W型微乳。使用自行设计的微乳注入装置，距离冷却水相表面的距离约6 cm，在电磁搅拌下（1 000 r/min）将热微乳以1滴/s的速度滴入温度为2 ℃的水分散介质中，当微乳全部加入后继续以2 ℃保温搅拌15 min，即得SLN。

2.5 Cur-SLN的评价指标

2.5.1 EE和载药量的测定 采用下式计算EE（%）和载药量（DL，%）[8]：

式中：m总为总药物的质量；m游离为游离药物的质量；m脂为脂质量；m乳化为乳化剂和助乳化剂的质量。

2.5.2 粒径分布、多分散指数和Zeta电位的测定 将Cur-SLN用去离子水稀释适当的倍数后，测定粒径、Zeta电位及多分散指数（PI）值。

2.6 单因素考察

考察选用不同乳化剂、脂质材料、脂质用量、药脂比、冷水相温度、微乳保温温度制备所得Cur-SLN的粒径、Zeta电位、PI值等指标。

2.6.1 不同乳化剂 固定硬脂酸用量为0.5 g，Km＝1 ∶4，硬脂酸与乳化剂溶液质量比为1 ∶10，投药量均为50 mg，固定其他制备条件，分别以聚山梨酯80、RH40及F68作为乳化剂，制备Cur-SLN。测定粒径、Zeta电位和PI值，结果见表1。

由表1及试验中观察可见，聚山梨酯80制得SLN的粒径最小，RH40制得的粒径最大，粒径分布也最宽（PI高），且室温放置有絮状物析出；而F68制得SLN的粒径分布最窄，但放置一段时间后略有混浊。结合伪三元相图筛选结果，选用聚山梨酯80为乳化剂。

表1 选用不同乳化剂、脂质材料、脂质用量所制SLN的各指标检测结果（n＝3）Tab 1 Results of indexes determination of SLN prepared with different emulsifiers，lipid materials，and amounts of lipids（n＝3）

2.6.2 不同脂质材料 以聚山梨酯80为乳化剂，乙醇为助乳化剂，Km＝1 ∶4，投药量均为50 mg，固定其他制备条件，改变脂质种类，分别选用单硬脂酸甘油酯、硬脂酸和磷脂，固定其用量为0.5 g，使其与乳化剂溶液的质量比为1 ∶10，制备Cur-SLN。测定粒径、Zeta电位和PI。经综合评价选用硬脂酸作为脂质材料，详见表1。

2.6.3 不同脂质用量 以硬脂酸为脂质，聚山梨酯80为乳化剂，乙醇为助乳化剂，Km＝1 ∶4，投药量均为50 mg，固定其他制备条件，改变硬脂酸的用量分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 g，使其与乳化剂溶液质量比为1∶10，制备Cur-SLN。测定粒径、Zeta电位和PI值。结果随着脂质用量的增大，粒径也逐渐变大；而PI值在一定范围内呈变窄趋势，达到一定值后反而变宽。故选用脂质用量为0.5 g，详见表1。

2.6.4 不同药脂比 以硬脂酸为脂质材料，分别固定脂质用量为0.5、1.0 g，聚山梨酯80为乳化剂、乙醇为助乳化剂，Km＝1 ∶4，固定其他制备条件，改变投药量，测定粒径和PI值。结果粒径随脂质用量增加而增大，脂质用量为0.5 g时粒径小于1.0 g时的平均粒径，前者的PI值也明显优于后者。粒径和PI值随药物用量的增减无明显规律，故选药脂比为1 ∶10，脂质用量为0.5 g，详见表2。

表2 不同药脂比对SLN粒径的影响（n＝3）Tab 2 Effects of different drug-to-lipid ratios on SLN particle size（n＝3）

2.6.5 不同冷水相温度 以硬脂酸（0.5 g）为脂质材料，投药量均为50 mg，聚山梨酯80为乳化剂，无水乙醇为助乳化剂，Km＝1 ∶4，固定其他制备条件，控制冷水相温度为2、10、25 ℃，制备Cur-SLN。测定粒径、Zeta电位和PI值。结果冷水相温度在2 ℃时，制备的SLN粒径和PI值更优，且在4 ℃放置更稳定，详见表3。

表3 不同冷水相温度、微乳保温温度所制SLN的各指标检测结果（n＝3）Tab 3 Results of the indexes determination of SLN prepared with different cold water phase temperatures and holding temperatures of microemulsion（n＝3）

2.6.6 微乳保温温度 制备条件同“2.6.5”项，控制微乳保温温度为65、72、80 ℃，制备Cur-SLN。测定其粒径、Zeta电位和PI值。结果以65 ℃时制备的SLN粒径和PI值更优，且在4 ℃放置更稳定，详见表3。

2.7 正交试验

根据单因素试验结果确定影响Cur-SLN的4个主要因素，即硬脂酸用量（A）、Cur的投药量（B）、冷水相温度（C）和微乳保温温度（D），设计4因素3水平正交设计表L9（34），见表4；以EE和DL为指标优化工艺参数，正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表4 因素与水平Tab 4 Factors and levels

表5 正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal test

以EE和DL为衡量指标分别进行直观分析，由极差值R确定影响因素顺序为：A＞B＞C＞D；以因素D为误差项进行方差分析的结果亦得出相同的结论。其中A因素影响显著（P＜0.05），因此，确定A1B2C1D1为优化处方，即硬脂酸的用量为0.5 g、Cur投药量为50 mg、冷水相温度为2 ℃、微乳保温温度为65 ℃。

表6 方差分析结果Tab 6 Results of analysis of variance

2.8 最优处方的验证

采用优化处方进行3次工艺验证试验，制备3批Cur-SLN样品，对其粒径、Zeta电位、PI、DL、EE进行测定。结果EE、DL、平均粒径、PI和Zeta电位的平均值分别为87.73%、7.72%、（156.9±2.2）nm、0.480、－24.8 mV，重现性良好（RSD＜2%，n＝3）。

2.9 Cur-SLN的稳定性研究

将留样的Cur-SLN置于4 ℃和25 ℃室温环境下储存0、1、3个月后，测定样品的粒径、Zeta电位及EE，观察变化。结果放置1个月后无论是在低温还是室温下，平均粒径皆呈不同程度的增大，低温下约增大1.7～21.4 nm，室温下约增大172.8～260.4 nm；而EE呈下降的趋势，低温下约下降1.3%～18.4%，室温下约下降12.5%～48.7%。样品的粒径和EE变化程度在低温下比室温下情况更小，表明低温更有利于样品的储存。

3个月后在低温下储存的样品平均粒径亦皆不同程度的增大，约增大22.7～72.0 nm；而EE呈现下降的趋势，低温下约下降3.2%～21.7%。在室温下部分样品出现絮状沉淀物，无法测定粒径和EE。这表明所制纳米粒不适合在室温下长时间（3个月）保存。

3 讨论

在试验中发现，去除SLN中的乙醇可采用旋转蒸发法或冷水介质稀释挥发法。旋转蒸发法制得的SLN其平均粒径及PI均超过标准；而采用冷水介质稀释挥发法制得的SLN平均粒径及PI均符合要求。以后一种方法所制得的SLN较清澈，可能系稀释的原因。

SLN的制备方法主要有高压乳匀法、薄膜-超声分散法、微乳法、溶剂扩散法、乳化超声法、溶剂蒸发法等。马艳等[9]采用薄膜-超声分散法制备Cur-SLN，考察卵磷脂、硬脂酸、Cur和聚山梨酯80用量对EE和DL的影响。所得Cur-SLN的EE和DL较高，但纳米分散液中可能出现粒径较大的微米级粒子；且由于使用二氯甲烷和丙酮等有机溶剂制备，若去除不完全会降低安全性。宋金春等[2]采用溶剂蒸发法制备Cur-SLN，以EE为指标进行正交试验，优选Cur、F68、山嵛酸甘油酯和卵磷脂用量，所得Cur-SLN的EE仅为67.4%，且由于其体系中的有机溶剂较难去除需关注安全性。孙冬妮等[10]采用热熔超声法制备Cur-SLN，以EE为指标进行正交试验优选脂质、药脂比、磷脂和F68用量，所得Cur-SLN的EE为90.23%。本试验采用微乳法制备Cur-SLN过程简单，对设备要求低，以EE和DL为指标，正交试验优选硬脂酸、Cur、冷水相温度和热微乳保温温度，所得纳米粒平均粒径较小，EE为87.73%。DL和EE均为纳米粒的重要考察指标，DL是指对纳米粒整体而言药物含量的高低；而EE则是指投药后药物利用率的大小，特别是分散在液体介质中的纳米粒，可能其中游离的药物含量较大，这种情况下EE是一个更加重要的衡量指标。但一味追求高的EE，会消耗过多囊材，导致DL降低，造成服药量增加。因此，应同时选取两者为考察指标，以在提高EE的同时兼顾DL。

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