褐藻素诱导人宫颈癌HeLa细胞的自噬作用机制研究

廖政邦，于五辈，赵 辉#（1.东莞市第五人民医院，广东东莞 53900；.河南大学药学院化学生物学研究所，河南开封 475004）

宫颈癌是病死率最高的常见妇科肿瘤，严重威胁着女性健康。复发的宫颈癌往往对临床常用的抗肿瘤药物耐药，因此亟需开发以新方式引起肿瘤细胞死亡的药物以克服耐药[1]。自噬是继凋亡和坏死后发现的第3种细胞死亡形式，虽然细胞通过自噬可以降解受损、衰老和失去功能的大分子或细胞器，维持细胞的内稳态，但自噬的过度激活又会损伤细胞器，促进自噬性细胞死亡。近年来发现很多药物可通过诱导肿瘤细胞自噬产生抗肿瘤作用，例如维生素K3可通过细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）途径介导宫颈癌HeLa细胞发生自噬[2]；麦冬皂苷B通过抑制蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又称Akt）、哺乳动物雷帕雷素靶蛋白（mTOR）通路介导HeLa细胞自噬[3]。以上研究表明，诱导肿瘤发生自噬是研发抗肿瘤药物的一种有效策略[4]。

褐藻素（Fucoxanthin）是一种具有独特结构的海洋类胡萝卜素成分，具有消痰、软坚散结、利水作用。现代医学研究表明，褐藻素具有抗肿瘤、促凋亡、抗炎及清除自由基等药理作用。已有研究表明，褐藻素可通过抑制Akt、mTOR的磷酸化来诱导肝癌HepG2细胞发生凋亡和自噬[5]。由于药物抗肿瘤作用机制往往取决于肿瘤类型，因而褐藻素是否对宫颈癌具有抗肿瘤作用尚不得而知，本研究对褐藻素抗宫颈癌作用及其分子机制进行了研究。

1 材料

1.1 仪器

FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；DMI3000B型倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）；Multiskan Spectrum型全波长酶标仪（美国热电公司）。

1.2 药品与试剂

胰蛋白酶、RPMI1640培养液、胎牛血清（美国Gibco公司）；褐藻素（纯度：98.0%）、洛霉素A1（Baf A1，纯度：98.0%）、新雷素（纯度：＞98%）、氯化铵（NH4Cl）、MTT、核糖核酸酶（RNase）A、吖啶橙、3-甲基腺嘌呤（3-MA，纯度：98.0%）、U0126（纯度：98.0%）、碘化丙啶、一抗均购自美国Sigma公司；细胞裂解液试剂盒、Lyso-Tracker Red、Hoechst33342、AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；Akt一抗、phospho-Akt（p-Akt）一抗、p21一抗、CDK2一抗、Cyclin D1一抗、Phospho-p70S6 kinase（p-p70S6K，Thr389）一抗、PTEN一抗、Phospho-mTOR（p-mTOR）一抗均购于美国Cell Signaling Technology公司；Beclin-1、LC3及相应二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.3 细胞

HeLa细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 细胞的培养[5]

细胞冻存液清洗后，加入RPMI1640培养液重悬细胞沉淀至细胞培养瓶中，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 细胞抑制率测定

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×105ml－1并接种于96孔培养板，培养12 h使细胞贴壁。以1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素，1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素+3-MA（5 mmol/L）培养细胞48 h。于试验终止前4 h每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl，37 ℃下继续孵育4 h后，终止培养。每孔加入二甲基亚砜100 μl，37 ℃下振荡30 min后，以酶标仪于570 nm波长处测定光密度（OD），以OD代表细胞活力并计算细胞抑制率与半数抑制浓度（IC50）[5]。

2.3 细胞周期与凋亡测定

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×105ml－1并接种于96孔培养板，培养12 h使细胞贴壁。以0（空白对照）、10、20、40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h。同一浓度重复3孔。培养细胞结束后以70%冰冷乙醇固定过夜，RNase A（50 μg/ml）处理后碘化丙啶（100 g/ml）避光染色，以流式细胞仪分析细胞周期分布；培养细胞结束后按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书处理细胞，以流式细胞仪分析细胞凋亡率[5]。

2.4 细胞自噬测定（自噬剂：3-MA）

2.4.1 吖啶橙染色法 取对数生长期的细胞，以5 000个/孔细胞接种于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h，弃去培养基。同一浓度重复3孔。吖啶橙（1 mg/ml）避光染色15 min，荧光显微镜观察并拍照，当细胞内酸性小囊泡增多时吖啶橙由绿色荧光转变成红色荧光。自噬抑制性试验则加入自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）培养细胞2 h后，再加入40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h，弃去培养基，染色方法同上[6]。试验设空白对照（0 μmol/L）。

2.4.2 Lyso-Tracker Red染色法 取对数生长期的细胞，以5 000个/孔细胞接种于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h，弃去培养基。同一浓度重复3孔。加入Lyso-Tracker Red（50 nmol/L）37 ℃避光染色45 min，Hoechst 33342（1 μmol/L）复染15 min，荧光显微镜观察并拍照，当溶酶体数量增加时红色荧光增强。自噬抑制性试验则加入自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）培养细胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h，弃去培养基，染色方法同上[6]。试验设空白对照（0 μmol/L）。

2.4.3 稳定转染HeLa-GFP-LC3细胞测试法 选择对数生长期细胞加入自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）培养细胞2 h，进行pGFP-LC3质粒转染，用新霉素筛选细胞克隆。收获HeLa-GFP-LC3细胞以5 000个/孔接种于6孔板，40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，荧光显微镜观察并拍照。细胞内绿色荧光呈点状分布则说明细胞发生自噬，反之呈弥散性绿色荧光。对于自噬抑制性试验则为加入自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）培养细胞2 h后再加入40 μ mol/L褐藻素培养细胞48 h，弃去培养基，染色方法同上[7]。试验设空白对照（0 μmol/L）。

2.5 细胞自噬相关蛋白的测定

以Western blot法测定蛋白表达。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×105ml－1并接种于96孔培养板，培养12 h使细胞贴壁，单独加入40 μmol/L褐藻素或者先加入自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）或U0126（10 μmol/L）培养细胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素，继续培养细胞48 h后，PBS洗3次，以离心半径为13.5 cm、1 000 r/min离心5 min后用细胞裂解液裂解细胞。同一浓度重复3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上样缓冲液，95 ℃变性10 min。8%聚丙烯酰胺-十二烷基磺酸钠（SDS）凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后依次加入相应的一抗和二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤5次，每次10 min。凝胶成像系统分析细胞自噬相关蛋白条带[5]。试验设空白对照（0 μmol/L）。

2.6 自噬流量测定

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×105ml－1并接种于96孔培养板，培养12 h使细胞贴壁。单独加入10 μmol/L褐藻素或先加入自噬抑制剂Baf A1或NH4Cl后，再加入10 μmol/L褐藻素，继续培养细胞48 h，测定LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、p62表达水平。对于溶酶体内Cathepsin D检测，则分别加入10、20、40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h后，PBS洗3次，以离心半径为13.5 cm、1 000 r/min离心5 min，用细胞裂解液裂解细胞后，测定Cathepsin D表达水平。同一浓度重复3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上样缓冲液，95 ℃变性10 min。8%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后依次加入相应的一抗和二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤5次，每次10 min。凝胶成像系统分析蛋白条带[5]。试验设空白对照（0 μmol/L）。

2.7 统计学方法

采用SPSS 12.0软件处理试验数据。各组数据均为计量资料，以表示，采用t检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞抑制率测定结果

1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素培养细胞48 h后，对细胞生长具有明显抑制作用，且呈浓度依赖关系，IC50为（55.1±7.6）μmol/L。细胞抑制率测定结果见表1。

表1 细胞抑制率测定结果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

表1 细胞抑制率测定结果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

3.2 细胞周期与凋亡测定结果

与空白对照比较，10、20、40 μmol/L褐藻素培养细胞48 h后，可剂量依赖性地阻滞细胞于G0/G1期，但对细胞凋亡无显著影响。细胞周期与凋亡测定结果见表2。

表2 细胞周期与凋亡测定结果Tab 2 Determination results of cell cycle and apoptosis

3.3 细胞自噬测定结果

吖啶橙染色结果表明，经40 μmol/L褐藻素处理48 h后，HeLa细胞内红色荧光明显增强，提示细胞内的酸性小囊泡增多；Lyso-Tracker Red染色结果进一步提示褐藻素可诱导溶酶体数量的增多及活性的增强；HeLa-GFP-LC3细胞内点状绿色荧光明显增多，而空白对照细胞内呈现弥散性绿色荧光。细胞自噬测定结果见图1。

图1 细胞自噬与相关蛋白测定结果（×20）A.吖啶橙染色；B.LysoTracker Red染色；C.HeLa-GFP-LC3细胞测试法；D.Beclin-1和LC3Ⅰ、LCⅡ表达；E.p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、Cyclin D1、CDK2、PTEN、p21表达Fig 1 Determination results of autophagy and related protein（s×20）A.acridine orange staining；B.LysoTracker Red staining；C.HeLa-GFPLC3 cell method；D.Beclin-1 and LC3Ⅰ，LCⅡexpression；E.p-Akt，p-mTOR，p-p70S6K，Cyclin D1，CDK2，PTEN，p21 expression

3.4 细胞自噬相关蛋白的测定结果

40 μmol/L褐藻素可增强自噬标志性蛋白Beclin-1的表达，可促进LC3 Ⅰ转变为LC3 Ⅱ，提示褐藻素诱导细胞发生了自噬。与空白对照比较，40 μmol/L褐藻素作用细胞48 h后，p-Akt及其下游靶蛋白p70S6K和p-mTOR表达减弱，总Akt蛋白表达并无明显改变；Akt信号通路的负调控蛋白PTEN表达增强，提示褐藻素通过Akt/mTOR信号通路诱导HeLa细胞发生了自噬。与空白对照比较，40 μmol/L褐藻素可抑制CDK2、Cyclin D1蛋白表达，增强p21蛋白表达。自噬抑制剂3-MA几乎完全逆转褐藻素对HeLa细胞的生长抑制作用，但对细胞凋亡无明显影响，提示褐藻素的生长抑制作用取决于自噬的发生。此外，3-MA部分逆转褐藻素对自噬相关蛋白表达的调控。细胞自噬相关蛋白的测定结果（自噬剂：3-MA）见图1。

3.5 细胞自噬流量测定结果

自噬的发生是一个连续的动态过程，自噬流量的检测能反映该过程。Baf A1是囊泡H+ATPases特异性抑制剂，可抑制酸性溶酶体和自噬体/溶酶体的形成。结果显示Baf A1可明显增加褐藻素诱导的LC3 Ⅱ蛋白的表达。NH4Cl通过抑制溶酶体酸化可以抑制自噬底物的降解，结果显示NH4Cl明显逆转了褐藻素诱导的p62表达降低。此外，褐藻素浓度依赖性地诱导分布在溶酶体内Cathepsin D表达上调。细胞自噬流量测定结果（自噬剂：Baf A1或NH4Cl）见图2。

3.4 细胞自噬相关蛋白测定结果（自噬剂：U0126）

综合上述试验可知，自噬发生的分子机制涉及多种信号通路。由于3-MA并不完全抑制褐藻素对AKT/mTOR信号通路中关键蛋白的调控，提示可能有其他信号通路参与褐藻素诱导的细胞自噬。经过筛选，笔者发现褐藻素活化MEK/ERK信号通路，而MEK抑制剂U0126不仅可以抑制MEK/ERK信号通路的活化，而且可以部分逆转褐藻素诱导的Beclin-1表达增强及LC3 Ⅰ转变为LC3 Ⅱ，提示MEK/ERK信号通路也参与了褐藻素诱导的细胞自噬。细胞自噬相关蛋白测定结果（自噬剂：U0126）见图3。

图2 细胞自噬流量测定结果（自噬剂：Baf A1或NH4Cl）A.褐藻素+Baf A1；B.褐藻素+NH4Cl；C.褐藻素Fig 2 Determination results of autophagy flow of cell（sautophagy agent：Baf A1 or NH4Cl）A.fucoidan+Baf A1；B.fucoxanthin+NH4Cl；C.fucoxanthin

图3 细胞自噬相关蛋白测定结果（自噬剂：U0126）Fig 3 Determination results of autophagy related proteins（autophagy agent：U0126）

4 讨论

自噬在肿瘤化疗中的作用目前仍未完全阐明，肿瘤细胞通过发生自噬得以存活并对抗药物的治疗作用，抑制自噬可以促进细胞凋亡，而一些抗肿瘤药物通过诱导肿瘤细胞发生自噬从而产生治疗作用[8]。本研究表明，褐藻素的抗HeLa细胞增殖作用几乎完全被自噬抑制剂3-MA逆转，说明其抗增殖作用是通过自噬产生的。此外，褐藻素并不诱导HeLa细胞发生凋亡，这与以前的研究结果不同：褐藻素诱导人肝癌HepG2细胞同时发生自噬和凋亡，且自噬是抑制凋亡[5]。以上结果提示褐藻素可通过不同的机制产生抗肿瘤作用，具有肿瘤细胞特异性。

自噬的发生是一个动态的连续过程，待降解物质由双层膜包裹而形成自噬体，随后与溶酶体融合并形成自噬溶酶体，溶酶体内的酸性水解酶消化水解待降解物质并释放回细胞质中，从而实现物质的循环利用[9]。褐藻素引起HeLa细胞内吖啶橙的红色荧光和Lyso-Tracker Red的红色荧光增强，提示褐藻素诱导HeLa细胞发生了自噬。此外，Beclin-1表达增加、LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ和HeLa-GFP-LC3转染细胞试验均进一步证实褐藻素诱导HeLa细胞发生了自噬。

Akt/mTOR信号通路往往参与细胞自噬的发生[10]。研究结果表明，褐藻素能明显调控Akt/mTOR信号通路中一些关键蛋白，如Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化以及上调PTEN（Akt/mTOR信号通路的负调控蛋白）的表达，提示褐藻素诱导HeLa细胞发生的自噬是通过抑制该信号通路中关键蛋白的活化产生的。由于3-MA并不完全抑制褐藻素对Akt/mTOR信号通路中关键蛋白的调控，提示可能有其他信号通路参与褐藻素诱导的细胞自噬。经过筛选发现，褐藻素通过使MEK1/2和ERK1/2磷酸化从而活化MEK/ERK信号通路，进一步研究表明MEK抑制剂U0126不仅可以抑制MEK/ERK信号通路的活化，而且可以部分逆转褐藻素诱导的Beclin-1表达增加及LC3 Ⅰ转变为LC3 Ⅱ，提示MEK/ERK信号通路也参与了褐藻素诱导的细胞自噬，即褐藻素通过抑制AKT/mTOR信号通路和激活MEK/ERK信号通路共同介导了HeLa细胞的自噬。此外，褐藻素是通过抑制p53、CDK2、Cyclin D1的表达以及促进p21的表达从而诱导HeLa细胞周期阻滞于G0/G1期。实验结果表明，褐藻素可诱导宫颈癌HeLa细胞发生自噬和细胞周期阻滞于G0/G1期，但并不诱导细胞凋亡。预孵自噬抑制剂3-MA后，褐藻素抗增殖作用被逆转，提示褐藻素抗HeLa细胞的作用取决于自噬，进一步研究表明褐藻素是通过抑制Akt信号通路以及激活MEK/ERK信号通路诱导HeLa细胞自噬。

本研究进一步完善了褐藻素抗肿瘤作用的分子机制，并为其应用于临床提供了理论基础和实验依据。

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