缺血性脑卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白质抗体及危险因素分析

王玮瑶 ，孙文萍，于洪泉，郑中华，赵东海，杨淑艳，齐 玲

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是除了高血压、糖尿病、心脏疾病、吸烟、饮酒等传统病因外的又一个引起缺血性脑卒中的危险因素［1］。Hcy 增高引起的血管内皮细胞受损等病理变化可导致动脉粥样硬化性脑梗死的发生和复发［2～5］。实际上体内70%～90%的Hcy 是以同型半胱氨酸化蛋白质的形式存在，这种形式的Hcy 远大于游离Hcy 和同型半胱氨酸硫内酯的含量，而被修饰后的蛋白质又会被机体识别成异体蛋白，引起一系列的免疫反应。因此，我们推测同型半胱氨酸化蛋白质抗体可能会与Hcy 一样成为缺血性脑卒中致病的重要组成部分。这方面研究国内还未见相关报道。本实验检测患者血清中Hcy 及同型半胱氨酸化蛋白质抗体等指标的水平，为缺血性脑卒中的防治提供更多的依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 L-同型半胱氨酸硫代内酯购自美国Sigma 公司，辣根酶标记抗人IgG 抗体购自美国Sigma 公司。二氨基联苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)显色试剂购自美国Epitomics 公司。J-26XP 超低温高速离心机(美国贝克曼公司);超低温冰箱(MDF-U53V，三洋);PLUS 384 全自动酶标仪(MDC 公司)。

1.2 研究对象 收集2012 年7 月～2012 年12 月入住北华大学附属医院神经三疗区患者的全血标本。样本总数共为111 例，其中男性患者65例，女性患者46 例;年龄34～82 岁，平均年龄62岁;其中75 人临床诊断为缺血性脑卒中患者，36 人为正常体检患者(作为正常对照组)。本研究通过北华大学附属医院伦理委员会的审核，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.3 研究方法

1.3.1 正常组和缺血性脑卒中组患者血清的获得 收集缺血性脑卒组及正常对照组人员的全血标本，将试管置于试管架上静置4 h 左右，置入高速离心机中，以3000 r/min 离心15 min，取上清分装放入1.5 ml 离心管中，标记后将所有标本放入4 ℃冰箱中，保存备用。

1.3.2 抗原制备 将0.2 mmol/L 同型半胱氨酸硫代内酯与10 mg/ml 人血白蛋白在pH 7.4，37 ℃的条件下配成作为抗原，4 ℃备用［6］。

1.3.3 ELISA 法检测患者血清中同型半胱氨酸化蛋白质抗体的表达 在96 孔酶标板中加入100 μl 抗原，与包被液共同孵育，4 ℃冰箱过夜;次日弃上清，每孔加入200 μl 1%BSA，37 ℃培养1 h(每个样本5 个复孔，同时设置阳性对照孔和空白对照孔)，PBST 洗涤后每孔加入100 μl 人血清置于4 ℃冰箱内过夜，用PBST 再次洗涤后加入100 μl(稀释1∶ 10000)辣根过氧化物酶标记的抗人IgG，37 ℃孵育1 h;显色，浓硫酸终止反应;于自动酶标仪492 nm 处测定(A)值，用标准品绘制标准曲线后计算样本浓度。

2 结果

2.1 血清同型半胱氨酸与同型半胱氨酸化蛋白质抗体水平 分析患者临床Hcy 检验提供数据显示:脑卒中组患者血清中Hcy 水平明显升高，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P ＜0.01)。ELISA 结果显示:脑卒中组患者血清中同型半胱氨酸化蛋白质抗体水平明显升高，与正常对照组比较，差异亦具有统计学差异(P ＜0.01)，见表1 所示。

2.2 血清生化指标、叶酸和维生素B12水平血清生化指标检测结果显示:脑卒中组患者甘油三酯、低密度脂蛋白和血糖呈升高趋势，尤其是脑卒中组血糖值明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。而总胆固醇、高密度脂蛋白呈下降趋势，与正常对照组比较，差异没有统计学意义(P ＞0.05)。脑卒中组患者的叶酸水平呈下降趋势，与正常对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);脑卒中组的维生素B12升高，与正常对照组比较，差异亦没有统计学差异(P ＞0.05)。结果如表2 所示。

表1 血清中同型半胱氨酸与同型半胱氨酸化蛋白质抗体水平

表2 血清中生化指标水平

3 讨论

脑卒中是临床上的常见病和多发病。近年来，脑卒中的发病人群越来越年轻化。缺血性脑卒中约占全部脑卒中的70%，已严重影响了人们的生活质量。很多脑卒中患者并无传统的危险因素，但是在各种缺血性疾病的发生发展过程中同型半胱氨酸发挥了重要的作用，它是动脉硬化性血管病发生的又一新的独立危险因素［7，8］。因此，本实验分析了缺血性脑卒中患者血清Hcy 水平，结果发现:缺血性脑卒中组患者的Hcy 水平明显地高于对照组，这与Hcy 已被公认为脑卒中危险因素之一的结论是相符的。

Hcy 在体内可以修饰蛋白质，修饰方式主要有N-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸硫代内酯为代表)和S-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸为代表)两类。同型半胱氨酸化的蛋白质在体内会被识别为自身抗原，进而引起自身免疫反应，形成同型半胱氨酸化蛋白质抗体，并在血管内皮表面形成复合物，再进一步损伤血管。当上述这一反应持续的、缓慢的发生，就会反复出现损伤-修复过程，最终损伤血管管壁，造成动脉粥样硬化引起脑卒中。在国外有用ELISA 法检测长期血液透析肾衰竭患者血中的同型半胱氨酸化蛋白质抗体的水平［9］，但尚无脑卒中患者同型半胱氨酸化蛋白质抗体水平的研究。因此，本实验应用ELISA 法检测缺血性脑卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白质抗体水平，发现患者同型半胱氨酸水平明显高于对照组。这说明缺血性脑卒中患者体内高Hcy 水平导致了过多的同型半胱氨酸化蛋白质抗体产生，这与脑卒中的发病可能有密切的关系。

除了Hcy 以外，血脂、血糖水平等都是引起脑卒中的传统危险因素。本实验也研究了这些传统因素对脑卒中的相关性。发现脑卒中组患者甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖呈升高趋势，血糖值则明显升高。而高密度脂蛋白则呈下降趋势，本实验结果与传统观点保持了一致性。本实验也研究了脑卒中组患者血清中叶酸、维生素B12的水平，发现患者血中的叶酸水平呈下降趋势，而维生素B12则升高。血液中蛋氨酸甲基化的过程需要叶酸和维生素B12作为辅基，因此，如果脑卒中的患者血中叶酸和维生素B12水平较低，患者血液的Hcy 就会有所升高，这与之前的研究结果相一致［9］。由此，我们可以认为叶酸的摄入增加可降低脑血管疾病的发生风险。但本实验中维生素B12结果与以往研究不同，还需要在以后更多病例的收集过程中，进行更深入的研究。

由于Hcy 已被公认为是脑卒中的独立危险因素，控制血清中Hcy 水平已成为预防和治疗脑卒中疾病的新环节。本实验通过分析证明了血中同型半胱氨酸化蛋白质抗体、Hcy 水平与脑卒中发病的联系以及传统因素的变化。可为临床脑卒中治疗和研究提供依据。

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