LMX1A抑制胃癌细胞系MKN45的生长和成瘤能力的研究

冯莉　廉伟　谢蕴

(复旦大学附属闵行医院消化内科， *病理科， 上海　201199)

·论著·

LMX1A抑制胃癌细胞系MKN45的生长和成瘤能力的研究

冯莉廉伟谢蕴*

(复旦大学附属闵行医院消化内科，*病理科， 上海201199)

摘要目的：探讨转录因子LMX1A(LIM homeobox transcription factor 1, alpha)对胃癌细胞系MKN45的生长及成瘤能力的影响。方法： 在胃癌细胞系MKN45中过表达LMX1A，检测空载或LMX1A过表达MKN45的生长及其在小鼠皮下的成瘤能力。结果：LMX1A诱发MKN45凋亡的同时抑制其生长并且能够显著抑制MKN45在小鼠皮下的成瘤能力(P<0.05)。结论：LMX1A作为肿瘤抑制因子在胃癌的发生发展过程中可能发挥作用。

关键词LMX1A；胃癌；MKN45

Study of LMX1A Inhibiting Growth and Tumorigenic Ability of MKN45 Gastric Cancer Cell LineFENGLiLIANWeiXIEYun*DepartmentofGastroenterology,*DepartmentofPathology,TheCentralHospitalofMinhangDistrict,FudanUniversity,Shanghai201199,China

AbstractObjective：To investigate the effect of LMX1A on growth and tumorigenic ability of MKN45 gastric cancer cell line. Methods:LMX1A was overexpressed in MKN45 gastric cancer cell line. And the proliferation and subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cell line with empty vector or overexpressed LMX1A in mice were detected. Results: LMX1A could induce the apoptosis of MKN45 and meanwhile inhibit its proliferation (P<0.05). Furthermore, overexpression of LMX1A could significantly inhibit subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cells in mice (P<0.05). Conclusions: LMX1A is a tumor suppressor in the development and progression of gastric cancer.

Key WordsLMX1A；Gastric cancer；MKN45

转录因子LMX1A (LIM homeobox trans-cription factor 1, alpha) 是包含LIM同源盒的基因家族的成员之一，它位于染色体1q24.1[1-2]。之前对敲除LMX1A基因小鼠的研究[3]发现，LMX1A是决定细胞分化命运的关键因子。在处于发育阶段的小脑中，LMX1A的缺失几乎完全阻滞了脊柱中神经管的发生[4]。LMX1A在肿瘤中的作用也逐渐被发现。比如，LMX1A能够抑制宫颈癌的转移[5]。LMX1A基因甲基化程度在宫颈鳞状细胞癌组织中比正常宫颈组织中高[6]。Dong等[7]的研究也发现，胃癌组织中LMX1A基因的启动子区发生高度甲基化，使LMX1A在癌组织中的表达低于癌旁组织，并且LMX1A在胃癌细胞系AGS中发挥肿瘤抑制作用。本研究探讨了LMX1A对胃癌细胞系MKN45的生长及其成瘤能力的影响，以明确LMX1A的肿瘤抑制作用。

1资料与方法

1.1细胞培养胃癌细胞系MKN45购自中国科学院细胞库，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中在37℃、5%CO2条件下进行培养。

1.2质粒构建采用反转录聚合酶链反应法得到LMX1A cDNA，用特异性引物扩增后连入pCMV4-flag载体，得到pCMV4-flag-LMX1A质粒。

1.3蛋白质印迹用预先加有蛋白酶抑制剂Cocktail(美国Sigma公司)的哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂(美国Pierce公司)从细胞中提取蛋白，然后进行蛋白质印迹实验[7]。

1.4细胞凋亡检测用胰酶消化细胞后离心，收集并悬浮于结合缓冲液中，然后分别加入膜联蛋白(Annexin-Ⅴ，美国BD Pharmingen公司)和碘化丙啶(propidium iodide，PI，美国BD Pharmingen公司)，室温标记15 min，用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)收集荧光信号。

1.5克隆形成实验在6 cm细胞培养皿底部铺一层0.6%低熔点琼脂糖，然后将含有1×103细胞的0.3%琼脂糖混悬后铺于其上。4周后，以直径>1 mm为准计算克隆数量。

1.6皮下肿瘤形成实验10只BALB/C裸鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)分别皮下注射1×106转染pCMV4-flag-LMX1A质粒或pCMV4-flag质粒(空载)的MKN45细胞，每种细胞接种5只小鼠。肿瘤大小以公式V=4/3π×L/2×(W/2)2计算得出，其中L代表中轴长，W代表中轴宽[7]。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用Student’st-test，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1LMX1A在胃癌细胞系MKN45中过表达构建pCMV4-flag-LMX1A质粒(LMX1A过表达质粒)并转染MKN45，观察LMX1A表达增强对胃癌细胞系MKN45的影响，以pCMV4-fla质粒(空载质粒)作为对照。图1示LMX1A在MKN45中成功表达。

图1将pCMV4-flag质粒(空载)和pCMV4-flag-LMX1A质粒分别转染入MKN45细胞中，得到空载细胞系MKN45-vector和LMX1A过表达细胞系MKN45-LMX1A，并用蛋白质印迹法检测flag-LMX1A表达情况

2.2LMX1A过表达负调控胃癌细胞系MKN45的存活等量的细胞经过Annexin-Ⅴ和PI分别标记后，在流式细胞仪上进行检测，结果发现，LMX1A过表达细胞中Annexin-Ⅴ单阳性细胞的比例显著增加，而PI单阳性以及Annexin-Ⅴ和PI双阳性的细胞比例没有增加，见图2A。LMX1A过表达使MKN45细胞凋亡增加(P<0.05)，见图2B。

图2空载细胞系MKN45-vector和LMX1A过表达细胞系MKN45-LMX1A进行Annexin-Ⅴ和PI双标记后，用流式细胞仪检测荧光信号(A)，并对3次实验的荧光强度进行统计，计算细胞凋亡率(B，Student’st-test；与MKN45-vector比较，#P<0.05)

2.3LMX1A过表达负调控胃癌细胞系MKN45的增殖通过克隆形成实验对空载和LMX1A过表达的MKN45细胞的生长情况进行观察，结果发现,相对于空载细胞，LMX1A过表达细胞的增殖能力明显减弱(P<0.05)，见图3。

图3空载细胞系MKN45-vector和LMX1A过表达细胞系MKN45-LMX1A分别进行克隆形成实验(A)，并对3次实验的结果进行统计(B，Student’st-test, 与MKN45-vector比较，#P<0.05)

2.4LMX1A过表达负调控胃癌细胞系MKN45的成瘤作用小鼠皮下肿瘤形成实验结果显示，LMX1A过表达的MKN45细胞的成瘤能力明显低于空载细胞，见图4。

图4将空载细胞系MKN45-vector和LMX1A过表达细胞系MKN45-LMX1A分别注射入裸鼠皮下。4周后观察皮下成瘤体积的差异(A)，测量后进行统计(B，Student’st-test, 与MKN45-vector比较，#P<0.05)

3讨论

胃癌占全球肿瘤死因的第二位[8]。尽管已经发现蔬菜和水果摄入不足以及幽门螺旋杆菌感染等和胃癌的发生相关，但是目前胃癌发生发展的分子机制还有待进一步研究[9]。

LMX1A作为转录因子在发育过程中发挥重要作用。越来越多的发育相关转录因子被报道参与肿瘤的发生发展，如Twist[10]、Snail[11-12]及Elf5[13]等，但LMX1A在胃癌发生发展过程中的作用尚不明确。前期研究[7]发现，由于甲基化程度增加，LMX1A在胃癌组织中的表达较癌旁组织低。而且无论是在胃癌细胞系AGS[7]中还是本研究应用的胃癌细胞系MKN45中，LMX1A的过表达都能够在引起细胞凋亡的同时抑制细胞生长，并抑制裸鼠皮下肿瘤的生成。以上结果证实，LMX1A在不止一种胃癌细胞系中具有肿瘤抑制作用，提示LMX1A在胃癌组织中表达的下降有利于肿瘤的发生。

肿瘤的发生发展包括肿瘤细胞的存活、生长和转移等，而本研究只关注了LMX1A对胃癌细胞的存活和生长的影响，今后，我们将研究LMX1A对胃癌转移的作用倾向。

参考文献

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[12]Cano A,Pérez-Moreno MA,Rodrigo I,et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression[J].Nat Cell Biol,2000,2(2):76-83.

[13]Chakrabarti R,Hwang J,Andres Blanco M,et al.Elf5 inhibits the epithelial-mesenchymal transition in mammary gland development and breast cancer metastasis by transcriptionally repressing Snail2[J].Nat Cell Biol,2012, 14(11):1212-1222.

基金项目：上海市自然科学基金项目(编号：10ZR1426300、134119b2600)

中图分类号R 735.2

文献标识码A