量子点制备和表征及标记黄曲霉毒素B1性能分析

韩 雍，汪 慧，宋 曦，李 响

(1 陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳 745000;2南京中医药大学第二临床医学院，南京 210023)

以金纳米颗粒、量子点、核壳型荧光纳米颗粒为代表的纳米粒子在生物芯片、免疫检测分析、基因突变检测、遗传病和肿瘤诊断、药物研究、食品及环境中强致病性病原菌的检测是食品安全检测技术发展的重要方向［1-3］。食品的中的残留真菌毒素引发的食物中毒是食品安全最为重要的隐患之一，其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最为严重，AFB1浓度较低的粮食和食品无法进行控制，传统的薄层层析TLC 和液相色谱法LC，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求;微生物法前处理较为繁琐，耗时较长;免疫学方法所用的抗体具有不稳定的特性;PCR 计数法对设备和技术要求高等。实现快速、高灵敏、低成本、实用性强的AFB1检测技术具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试材料 大米，市售。

1.1.2 仪器与试剂 仪器:JEM2100 透射电镜(TEM)、RF5301 荧光分光光度计、Biorad 电泳仪、WH-3 微型漩涡混合仪、HYG-Ⅱa 回转式恒温调速摇瓶柜、TGL-16C 离心机、DF-101S 型集热式磁力加速搅拌器、PYX-DH5-50 隔水式电热恒温培养箱等。试剂:AFB1、羧基甲氧基拉明半盐酸(CMO)、1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亚胺盐酸盐(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、甲醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、3-乙酰基吡啶、磷酸盐缓冲液，以上试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 碲化镉量子点的制备与表征 参照文献［4］的方法加以改进，具体步骤为:①碲氢化钠的合成:在50mL 圆底烧瓶内首先加入0.031 9g 碲粉(0.025mmol)、紧接着加入5mL 超纯水、然后加入0.038 0g 硼氢化钠(1.2mmol)，充氮气保护，在室温条件进行搅拌反应，溶液变成淡紫色结束反应。②巯基丙酸-碲配合物的形成:在250mL 三口圆底烧瓶中首先加入200mL 超纯水、然后添加0.114 2g 水合氯化镉(0.5mmol)和0.109 2g巯基丙酸 (1.2mmol)，并用NaOH 容易调节pH 至11.2，充氮气维持约30min。③碲化镉纳米晶的制备:将步骤②制备所得溶液添加在巯基丙酸-镉溶液中，充氮保护，在120℃进行回流反应约7h，将反应物进行透射电镜扫描和荧光分光光度计对其形状进行表征。

1.2.2 量子点与IgG 的结合与表征 试验通过试剂EDC 和NHS 将羊抗兔IgG 连接到碲化镉量子点表面［5］，参照文献［6］方法，优化进行，具体操作为:①取400μL 的CdTe 量子点溶液，与40μL 含有2mgEDC 的PBS (0.01mol/L，pH 7.4)，在室温下混合5min，再在摇床中反应15～20min。②接着加入0.5mgNHS 混合15min。③最后加入800μL 的IgG (400μL 2mg/mL IgG和400μL PBS 的混合液)，在摇床中混合2h。在4℃下，5 000r/min，离心15min，以除去未反应的IgG，吸出上清液，用PBS 清洗1 次后，再离心，沉淀加2mL 超纯水溶解，将最终产品保存在4℃。

采用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳［7］对CdTe 量子点与羊抗兔IgG 的结合物进行表征。电泳凝胶采用12%聚丙烯酰胺分离凝胶，首先在80V/cm 的速度条件下进行15min，然后在120V/cm 条件下持续进行，直至电泳操作结束。由于考马斯亮蓝染色会干扰量子点的荧光强度，因此用凝胶成像仪紫外灯下观察电泳情况，电泳结束后进行染色处理，在自然光下观察电泳结果。

1.2.3 AFB1的检测 将制备的AFB1人工抗原包被在微孔板上，洗涤拍干后用BSA 溶液封闭。将标准AFB1溶液梯度稀释，稀释倍数10－6～10－9，按浓度梯度加入离心管中，再加入适当浓度的黄曲霉毒素单克隆抗体，37℃孵育。将离心管中混合液加入包被有AFB1完全抗原的平板上，在37℃恒温箱内孵育用PBS (0.01mol/L，pH7.4)洗涤，加入标记有CdTe 量子点的羊抗兔-IgG(二抗)孵育，洗涤拍干后加200μL/孔的超纯水，置于荧光/化学发光分析仪上检测，得到荧光强度曲线。

2 结果与分析

2.1 碲化镉量子点纳米材料的制备和表征

本试验以镉盐、碲粉为基础材料，以巯基丙酸为量子点包裹剂，利用水溶性长链巯基类化合物包裹的合成方法制备碲化镉量子点，并在水相中按照不同反应时间，制备了不同发射波长的碲化镉量子点。通过TEM观察碲化镉量子点的粒径和形状，利用荧光分光光度计对碲化镉量子点水溶液进行光谱性质分析。分析结果显示，本试验所合成巯基类化合物包覆的碲化镉量子点具有水溶性好、稳定性好、荧光量子产率高、易于生物标记等特点。由图1 可知，试验合成的量子点的粒径约为5nm，呈球形分散，在水溶液中能够较好的分散。由图2 可知，在280nm 波长的激发光作用下，碲化镉量子点的最大发射波长为560nm，其检测光谱可读性得到显著提高。

图1 碲化镉量子点的透射电镜图

2.2 碲化镉量子点与羊抗兔-IgG 的结合和表征

图2 碲化镉量子点的荧光光谱

试验采用无毒、生物相容性良好的EDC 和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作为羊抗兔-IgG 的交联剂［4］，严格控制试验条件，实现碲化镉量子点与IgG 交联，利用凝胶电泳判断碲化镉量子点表面是否成功标记IgG，通过SDS-PAGE 方法对CdTe 量子点与IgG 的结合情况进行表征。将CdTe 量子点、羊抗兔IgG、CdTe 量子点与IgG 结合物和蛋白质Marker 依次编号为1、2、3 和4。按照试验方法1.2.2 操作，获得紫外光和自然光下电泳观察图，以此判断量子点与免疫球蛋白结合情况。图3中，左图在紫外线下观察，可见1 道和3 道的亮带，表明电泳物质中存在CdTe 量子点。右图在自然光下观察，可见2 道和3 道处于相近位置，表明电泳物质中含有羊抗兔IgG。由此可见，试验所得碲化镉量子点与羊抗兔-IgG 成功结合，并能够在电泳条件下顺利分离。

图3 QDs-IgG 的12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.3 AFB1的检测

在最佳的实验条件下，荧光强度与AFB1浓度在稀释10－6～10－9的倍数范围内，即1～1 000ng/mL 下呈良好的线性关系，得到的检出限为0.3 ng/mL (图4)。

图4 标准AFB1与荧光强度的关系曲线

取市场上销售的大米，捣碎，加入不同稀释倍数的AFB1，稀释倍数为10－6～10－9，用本试验方法测定荧光强度，并计算回收率，回收率89.0%～101.07% (附表)，说明本试验所建立的新型检测技术的灵敏度和准确性较高，可以用于实际样品中AFB1的检测。

附表 大米样品中AFB1的检测回收率

3 结论与讨论

利用碲粉、水合氯化铬和巯基丙酸在水相中成功合成了新型发光量子点碲化镉量子点，通过TEM、荧光分光光度计的表征，表明所制备球形纳米颗粒具有良好的分散性和均一性，荧光发射特征与量子点基本保持一致，光稳定性得到大幅度提高。将所制备的碲化镉量子点纳米颗粒通过EDC 和NHS 和羊抗兔-IgG 结合，然后通过电泳分析和TEM 表征，表明成功地将碲化镉量子点与羊抗兔IgG 结合。通过对新制备的量子点与IgG 结合物进行分析性能研究，本试验建立了适用于检测AFB1的高灵敏分析方法，检测限可达1 ng/mL。

［1］张志，崔作林.纳米技术与纳米材料［M］.北京:国防工业出版社，2000:1-65.

［2］薛群基，徐康.纳米化学［J］.化学进展，2000，12(4):431-444.

［3］秘大圣，等.纳米技术在食品安全中的应用研究进展［M］.中国食品添加剂，2008，1:143-146.

［4］刘哗，向蓉，黄菊，等.碲化镉量子点光催化降解溴化乙锭的研究［J］.化学学报，2008，66(2):276-280.

［5］Xing Y，Chaudry Q，shen C，et al.Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry.Nat.Protoc，2007，2(5):1152-1165.

［6］So M K，et al.Creating self-illuminating quantum dot conjugates ［J］.Nat Proto，2006，1(3):1160-1164.

［7］Hu F，Ran Y，Zhou Z，Gao M.Preparation of bioconjugates of CdTe nanocrystals for cancer marker detection ［J］.Nanotechnology，2006，17(12):2972-2977.

［8］Wang C Y，Zhang Y J.Apoptin Gene Transfer via Modified Wheat Histone H4 Facilitates Apoptosis of Human Ovarian Cancer Cells ［J］.Cancer Biotherapy and Radiopharmaceyticals，2010，26:121-126.

［9］Shao D，Zeng Q H，Fan Z，et al.Monitoring HSV-TK/ganciclovir cancer suicide gene therapy using CdTe/CdS core/shell quantum dots ［J］.Biomaterials，2012，33:4336-4344.

［10］Bin N H，Palui G，Rosenberg J T，et al.Multidentate Catechol-Based Polyethylene Glycol Oligomers Provide Enhanced Stability and Biocompatibility to Iron Oxide Nanoparticies ［J］.ACS Nano，2012，6:389-399.

［11］中华人民共和国国家标准《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［12］孙亚宁，胡骁飞，邓瑞广，等.赭曲霉毒素A 人工抗原的合成与鉴定［J］.食品工业科技，2011，5:172-175.

［13］生物偶联过程对于聚合物包覆的水溶性CdS/ZnS 核壳量子点发光的影响［J］.发光学报，2010，31:101-104.