白首乌C21甾苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

惠 勇，徐 雷

(1.牡丹江市第二人民医院循环内二科，黑龙江牡丹江 157011;2.牡丹江市第一人民医院泌尿外科，黑龙江牡丹江 157011)

缺血性心脏病发病率逐渐升高，心脏长期缺血导致心肌收缩功能出现障碍引起心力衰竭(CH)，是致使人体残疾或死亡的首要病因［1］。虽然尽早恢复缺血心肌的血供，可能减少心肌不可逆的损伤，但是再灌注后可导致缺血的心肌损伤更为严重［2］。因此，如何有效地减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤俨然成为治疗缺血性心脏病的最大挑战。现代化学研究表明，白首乌中含有磷脂类、C21体酯苷、黄酮类化合物、多糖类及微量元素等多种成分，具有明显的抗肿瘤、调节免疫和抗衰老等多种药理作用。白首乌C21甾苷能够清除超氧阴离子自由基和羟自由基，是白首乌中的主要活性成分［3］，但是白首乌C21甾苷对心肌I/R 损伤的影响鲜见报道。本研究旨在观察白首乌C21甾苷对心肌I/R 损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级Wistar 系雄性大鼠40 只，体重200～250g，购于哈尔滨医科大学动物实验中心。实验动物合格证号为:P00102008、实验动物使用许可证号:SYXK (黑)2008-033。饲养于标准环境，自由饮食，12h 光照周期。实验操作遵守中国动物实用指南。

1.2 白首乌C21甾苷的提取

白首乌粗粉用95% 乙醇回流提取，减压回收溶剂得萃取物。萃取物稀释后上大孔树脂(D101)层析，水和95 %乙醇洗脱、收集95% 乙醇部分洗脱液;选择薄层色谱法进行定性分析;选择紫外分光光度法测定C21甾体总苷的含量［4］。经分析，C21甾苷的可测成分含量达65 %左右(按孕甾烯醇酮计)。

1.3 大鼠在体心肌缺血再灌注模型制备

手术之前禁食12h，可自由饮水，称重后，腹腔注射100mg/kg 氯胺酮和5mg/kg 甲苯噻嗪，麻醉5～10min 后固定于实验台，气管插管接呼吸机行机械通气(呼吸频率70 次/min，潮气量6～7 mL/次)，分离右侧颈动脉，经颈动脉行左心室置管，记录大鼠左心功能变化，选用标准II 导联连接心电图，计算机软件记录波形。经左前胸第3、4 肋间开胸，打开心包，挤出大部分心脏，暴露心脏及左心耳，以5/0 线在距LAD 根部1～2 mm 系1 个袢，其间穿过1 根塑料管，拉紧袢，观察心电图变化，ST 抬高为结扎成功，结扎线以下心肌组织颜色变暗。25min 后拔出塑料管，使冠状动脉血流再通40min，再灌时局部组织充血。再灌注成功标准:ST 段回落，心尖复红［5-6］。

1.4 分组与处理

驯化1w 后随机分为4 组:假手术组:大鼠麻醉后，打开胸腔，LAD 下穿线但不结扎;缺血再灌注组:手术结扎LAD 缺血25min，再灌注40 min;去势组:大鼠手术去势后恢复4w，然后再手术结扎LAD缺血25min，再灌注40 min;白首乌C21甾苷治疗组:结扎LAD 手术前1w 胃给予白首乌C21甾苷1.0 g/ kg，连续7d，然后进行手术结扎LAD 缺血25min，再灌注40 min。对照组，缺血再关注组和去势组分别灌胃等体积的蒸馏水。

1.5 心肌组织TNF-α 和IL-6 含量检测

离体心脏组织冰盐水冲洗以去除任何红细胞或血块，匀浆缓冲液洗涤1 次，加4 倍体积匀浆缓冲液，冰上匀浆，4℃，2 500r/min 离心20min，取上清，然后根据ELISA 试剂盒说明书对TNF-α、IL-6 进行检测。

1.6 cTnT 的测定

实验结束时，心脏取血约2mL，EDTA (22mg/mL)抗凝，3 000r/min 离心15min，取上清，然后根据cTnT ELISA 试剂盒说明书进行检测。

1.7 心肌组织病理学分析

心肌组织用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、苏木精和伊红染色、数字显微镜扫描。评分制评价组织细胞损伤程度:0 分(没有损伤);1 分(轻度损伤)，间质水肿和局灶性坏死;2 分(中度损伤)，弥散性心肌细胞溶胀和坏死;3 分(严重损伤)，细胞融合性坏死并伴随中性粒细胞浸润;4 分(极严重损伤)，广泛的细胞融合性坏死，中性粒细胞浸润及出血［7］。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 心肌组织TNF-α、IL-6 含量测定结果

与假手术组比较，缺血再灌注组心肌组织TNF-α，IL-6 含量明显升高，差异具有统计学意义;与缺血再灌注组比较，去势组和白首乌C21甾苷治疗组心肌组织TNF-α、IL-6 含量明显降低，差异具有统计学意义，但是去势组和白首乌C21甾苷治疗组之间没有显著性差异(附表)。

2.2 cTnT 含量测定结果

与假手术组比较，缺血再灌注组cTnT 含量明显升高，差异具有统计学意义;与缺血再灌注组比较，去势组和白首乌C21甾苷治疗组cTnT 含量明显降低，差异具有统计学意义，但是去势组和白首乌C21甾苷治疗组之间没有显著性差异。(附表)。

附表 心肌组织TNF-α、IL-6 含量和cTnT 含量测定结果

2.3 心肌组织病理学分析结果

假手术组(0 分):未见明显异常，显示心肌正常结构;缺血再灌注组(4 分):明显的心肌损伤，可见心肌广泛融合性病变，心肌细胞断裂、水肿，并且有中性粒细胞浸润;去势组和白首乌C21甾苷治疗组(1分):仅见细胞有轻度水肿，未见片状坏，肌纤维排列较为整齐(附图)。

附图 小鼠心肌组织组织病理学切片(40 ×)

3 讨论

在心肌缺血再灌注过程中，虽然再灌注可以改善心肌的血液供应，但也会加重心肌缺血所造成的损伤，导致血流动力学障碍、心功能异常、心肌细胞坏死和凋亡，严重危害患者的生命［8］，因此，对抗缺血及心肌I/R 损伤所引起的心肌梗死及功能障碍才是治疗缺血性心脏病的根本目的。炎症反应在心肌I/R 损伤中发挥了重要作用，因此，抑制炎症反应在防治心肌I/R 损伤中具有重要意义［9］。近年来，大量研究表明，炎症反应参与了心肌I/R 损伤的形成。冠状动脉再通后，中性粒细胞能够释放IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、细胞间黏附分子(ICAM)等炎症因子，这些炎症因子相互影响、相互作用，能够促进血管内皮细胞的通透性增加、中性粒细胞的黏附，通过血管壁等活动，进而导致心肌的损伤或心肌细胞的凋亡等［10］。TNF-α 是一种重要的炎性细胞因子，在正常的心肌组织中含量很低，但是当急性心肌I/R 后于数分钟由巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞大量释放。过量的TNF-α 致心脏的损伤，同时促进IL-6 的释放增加［11］。另外，邹吉丽等［6］研究表明，心肌细胞产生IL-6 主要由缺血及再灌注诱导。cTnT 作为心肌细胞所特有的一种调钙蛋白，具有高度的心肌特异性，健康人的血清中cTnT 含量很低。虽然cTnT 在血中半衰期较短，仅2h，但由于其在细胞内分布且含量丰富，并由坏死的结构蛋白不断释放，使其在血中异常时间可持续6d 甚至数周，其被美国和欧洲心脏协会一致评价为确诊急性心肌梗死的高特异性和高敏感性的血清学标志物，其血清水平升高提示心肌细胞坏死［12-13］。

本研究结果表明，与假手术组比较，缺血再灌注组TNF-α 和IL-6 含量明显升高，由此可见，心肌缺血再灌注加重了心肌的损伤;与缺血再灌注组比较，白首乌C21甾苷治疗组可明显降低TNF-α 和IL-6 含量;本研究还发现，缺血再灌注组cTnT 含量明显升高，由此可见，心肌I/R 损伤可引起心肌组织的梗死。与缺血再灌注组比较，白首乌C21甾苷治疗组可明显降低cTnT 含量，缩小梗死面积。同时组织病理学也发现缺血再灌注组表现出明显的心肌损伤，可见明显的心肌损伤，可见心肌广泛融合性病变，心肌细胞断裂、水肿，并且有中性粒细胞浸润，白首乌C21甾苷治疗组仅显示轻度损伤。

综上所述，白首乌C21甾苷可显著抑制心肌炎症因子，减轻心肌组织形态损伤，缩小梗死面积，改善受损的心肌功能，从而起到保护心肌的作用，具体作用机制有待于进一步研究。睾酮在心肌损伤过程中的作用可能是非常重要的，如睾酮对心肌细胞的损伤主要是通过促炎因子的释放增加可促进心脏功能障碍和重构［14-15］。本研究所设置的去势组的结果与白首乌C21甾苷治疗组结果相同，所以白首乌C21甾苷是否拮抗雄激素的作用也是本研究进一步研究的目标。

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