橘核的HPLC指纹图谱研究及聚类分析

罗 静，何中燕，裴 瑾，康亚兰，刘 薇（.成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室，成都 637；2.四川科伦药物研究院有限公司，成都 6007）

橘核为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟种子，具有理气、散结、止痛的功效，临床主要用于治疗急性乳腺炎、乳腺增生[1]等疾病，具有较高的药用价值[2-3]。有研究表明，橘核的主要有效组分为柠檬苦素类似物[4]，该类化合物具有抗肿瘤[5-6]、抗病毒[7]、镇痛、消炎、催眠镇静[8]等多种作用，有良好的开发应用前景。

柑橘属植物也是世界上最重要的经济作物之一，该属的分类、进化和重要栽培（杂）种的起源等问题目前尚没有统一的观点[9]。2010年版《中国药典》（一部）仅收载了橘核的“性状”“横切面鉴别”等项的鉴别方法[10]，尚无全面的质量控制标准。为此，本研究收集了广西玉林、河北安国、成都荷花池、安徽亳州等国内几个主要药材市场的11批橘核样品以及7批不同品种的自采橘核样品，采用高效液相色谱（HPLC）法建立了不同产地、不同品种18批橘核药材的指纹图谱[11]，以期为橘核的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪，配有DAD二极管阵列检测器、Chemstation色谱工作站（美国安捷伦公司）；KQ 5200E型超声机（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；千分之一电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

柠檬苦素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110800-201205）；诺米林对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号：121010，纯度≥98%）；乙腈为色谱纯，石油醚、甲醇为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

18批橘核药材来源见表1。所有药材样品均经成都中医药大学药学院药植与鉴定教研室裴瑾教授鉴定为橘C.reticulataBlanco或其栽培变种的干燥成熟种子。

表1 18批橘核药材来源Tab 1 Source of 18 batches ofC.reticulate

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.3%磷酸水溶液，梯度洗脱程序见表2；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取柠檬苦素、诺米林对照品各适量，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取橘核样品粉末（过3号筛）约1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）20 ml，超声脱酯20 min后，弃去石油醚液，残渣加甲醇20 ml，超声提取30 min，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取“2.2”项下供试品溶液、对照品溶液及甲醇各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有相同的色谱峰，溶剂甲醇无干扰。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果，柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD分别为1.03%、1.02%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液适量，于制备0、2、4、8、12 h时分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD分别为1.70%、1.29%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批橘核药材样品（JH07）共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD分别为1.85%、1.66%，表明本法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 指纹图谱的测定 取18批橘核药材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，得特征指纹色谱峰，详见图1。将不同批次橘核药材的指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（研究版），结果发现，18批橘核药材共有的特征峰有11个。以柠檬苦素参照物为内标，确定柠檬苦素（9号峰）为参照峰。样品指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积值分别见表3、表4。

图1 特征指纹色谱峰Fig 1 Common peaks of HPLC fingerprint

表3 样品指纹图谱共有峰的相对保留时间Tab 3 Relative retention time of fingerprint common peak

2.4.2 相似度分析 18批橘核药材的HPLC指纹图谱见图2。经计算，各个样品图谱与对照品图谱的相似度均＞0.90，表明所建立的指纹图谱技术指标稳定、重复性好，不同产地橘核的主成分基本相同。相似度分析结果见表5。

2.4.3 聚类分析 以欧氏距离作为相似程度指标，对18批橘核样品色谱峰的相对保留时间及相对峰面积数据进行分析，采用类平均法为聚类方法对样品进行归类，结果见图3。

由图3可见，橘核药材依据其指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积被聚为两大类：第一大类包括所有市售橘核样品（JH01～JH11）。第二大类为自采橘核样品（JH12～JH18）。说明采集方式的不同对橘核药材各成分的含量有影响。第一大类又被聚为两组，第一组包括广东、四川、江西等地所产的橘核样品，第二组包括广西、湖南、江苏、浙江等地所产的橘核样品。可见，不同产地的土壤、海拔和其他气候条件等对于橘核中有效成分柠檬苦素和诺米林的含量有一定的影响。第二大类又被聚为两组，第一组为椪柑的种子，第二组为福橘的种子，表明不同品种柑橘的种子在柠檬苦素和诺米林的含量上也显示出差异。

表4 样品指纹图谱共有峰的相对峰面积值Tab 4 Relative peak area of fingerprint common peak

图2 18批橘核药材的HPLC指纹图谱S1～S18.1～18批橘核药材；R.对照图谱Fig 2 Fingerprint of 18 batches ofC.reticulateS1-S18.1-18 batches ofC.reticulate；R.reference fingerprint

表5 18批橘核药材的相似度分析结果Tab 5 Analysis of the similarity of 18 bacthes ofC.reticulate

图3 18批橘核药材HPLC指纹图谱的聚类分析树状图Fig 3 Cluster analysis of HPLC fingerprint of 18 batches ofC.reticulate

3 讨论

由于橘核药材中含柠檬苦素、黄酮类等成分，因此本研究将橘核样品经石油醚脱酯、甲醇提取后，制备成供试品溶液注入HPLC仪进样分析。笔者曾选择210、254、300 nm等波长对橘核样品进行测定，结果发现，以210 nm作为检测波长的色谱图基线平稳、分离效果好、峰数较多，所反映的化学信息较多；而其他波长检测到的色谱图有基线漂移现象。因此，本研究最终选择210 nm作为检测波长。因橘核药材所含成分较为复杂，各种类型的化合物极性差别较大，故本研究采用梯度洗脱的方式。笔者曾比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水溶液等流动相系统，结果表明采用乙腈-0.3%磷酸水溶液梯度洗脱可使样品得到更好的分离，且色谱峰峰形较好，故选用该系统为流动相。

综上所述，本研究所收集的18批橘核样本的HPLC指纹图谱较为相似，说明橘核药材在化学成分上比较稳定；用于指纹图谱分析的药材的共有色谱峰相似系数均在0.90以上，表明本研究结果可作为橘核药材的鉴定和质量评价的依据。

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