HPLC法测定硫磺熏蒸与未熏蒸北沙参中5种香豆素类成分的含量Δ

牛 韬（山东中医药大学附属医院，济南 250014）

北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis的干燥根，具有养阴清肺、益胃生津之功效。常用于肺热燥咳，劳嗽痰血，胃阴不足，热病津伤，咽干口渴[1]。作为药材的一种传统养护方法，硫磺熏蒸在中药材及饮片的加工、贮藏中应用普遍。硫磺熏蒸可导致中药材中二氧化硫（SO2）、砷、汞等重金属残留超标[2]，有效成分损失和改变[3]，药材毒性增加[4]，还直接影响了患者的用药安全和疗效。为此，国家采取各项措施限制硫磺熏蒸在中药材及饮片加工过程中的使用，并将SO2检测方法列入2010年版《中国药典》附录中。在本研究中笔者拟用高效液相色谱（HPLC）法测定硫磺熏蒸及未熏蒸北沙参药材中补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素5 种香豆素类成分的含量，探讨硫磺熏蒸对北沙参有效成分的影响。

1 材料

2996型HPLC仪，包括2996二极管检测器（美国Waters公司）；AE200 型电子天平（上海台衡仪器仪表有限公司）；AB135-S型电子分析天平、KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

补骨脂素对照品（批号：110739-201115）、欧前胡素对照品（批号：110826-201214）、异欧前胡素对照品（批号：110827-201109）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；花椒毒素对照品（批号：20130324）、佛手柑内酯对照品（批号：20121027）均购于武汉天植生物技术有限公司，纯度均＞98%；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、甲醇为分析纯，水为纯净水。

北沙参采自山东烟台莱阳胡城村、河北安国明官店乡霍庄村、山东烟台海阳小纪镇、山东威海文登昆嵛镇，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为真品，部分不熏蒸，部分由笔者自行熏蒸；硫磺熏蒸北沙参饮片购自安徽亳州中药材市场（批号：131001）、河北安国中药材市场（批号：131017）、山东海阳中药材市场（批号：130619）、山东烟台三联中药材市场（批号：130611）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～18 min，24%→50%A；18～25 min，50%→64%A；25～33 min，64%→72%A；33～40 min，72%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：295 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取补骨脂素对照品2.43 mg、花椒毒素对照品7.78 mg、佛手柑内酯对照品1.10 mg、欧前胡素对照品1.41 mg、异欧前胡素对照品1.85 mg，置于同一100 ml量瓶中，加入75%乙醇溶解并定容，制得补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素质量浓度分别为24.3、77.8、11.0、14.1、18.5 μg/L的混合对照品贮备液；精密量取上述贮备液适量，加入75%乙醇溶解，制得补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素质量浓度分别为12.2、38.9、5.5、7.1、9.3 μg/L的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 分别取硫磺熏蒸与未熏蒸北沙参粉末（过4号筛）各约2 g，分别置于50 ml量瓶中，加入75%甲醇20 ml，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对混合照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，各成分分离效果良好，理论板数以补骨脂素峰面积计均大于3 000。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.硫磺未熏蒸北沙参供试品；C.硫磺熏蒸北沙参供试品；1.补骨脂素；2.花椒毒素；3.佛手柑内酯；4.欧前胡素；5异欧前胡素Fig 1 HPLC ChromatogramsA.mixed reference；B.test samples of G.littoralis with no sulphur fumigation；C.test samples of G.littoralis with sulphur fumigation；1.psoralen；2.xanthotoxin；3.bergapten；4.imperatorin；5.isoimporatorin

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，采用逐级稀释法依次制得稀释倍数为1、2、4、10、20、40、100 的系列质量浓度混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/L）为横坐标、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的回归方程分别为y＝99 911x－8 180.1（r＝0.999 8）、y＝59 343x－147 36（r＝0.999 9）、y＝150 000x－4 441.9（r＝0.999 7）、y＝54 709x－2 222.2（r＝0.999 8）、y＝65 659x－3 567.2（r＝0.999 7）。结果表明，补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的质量浓度分别在0.121 5～12.15、0.389～38.9、0.055～5.5、0.070 5～7.05、0.092 5～9.25 μg/L范围内与各自峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果，补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素峰面积的RSD 分别为0.12%、0.08%、0.65%、0.70%、0.38%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取硫磺熏蒸北沙参（批号：131001）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素峰面积的RSD分别为0.69%、2.61%、0.96%、2.78%、2.15%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取硫磺熏蒸北沙参（批号：131001）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素峰面积的RSD 分别为0.91%、0.96%、1.08%、2.82%、2.73%（n＝6），表明本方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的硫磺熏蒸北沙参（批号：131001）粉末（过4 号筛）6 份，每份1 g，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，补骨脂素加样回收率为98.55%～99.54%，RSD为0.71%（n＝6）；花椒毒素加样回收率为98.44%～101.29%，RSD为1.72%（n＝6）；佛手柑内酯加样回收率为98.01%～100.06%，RSD 为1.34%（n＝6）；欧前胡素加样回收率为100.05%～101.77%，RSD 为2.32%（n＝6）；异欧前胡素加样回收率为100.32%～101.97%，RSD 为0.89%（n＝6）。

2.9 样品含量测定

分别称取不同产地硫磺未熏蒸、自行熏蒸北沙参与硫磺熏蒸饮片各适量，粉碎，过4号筛，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以外标法计算香豆素类成分的含量，详见表1[编号1～4 分别为山东烟台莱阳胡城村、河北安国明官店乡霍庄村、山东烟台海阳小纪镇、山东威海文登昆嵛镇采摘的药材；编号5～8 分别为上述产地药材自行熏蒸所得供试品；编号9～12分别为安徽亳州中药材市场（批号：131001）、河北安国中药材市场（批号：131017）、山东海阳中药材市场（批号：130619）、山东烟台三联中药材市场（批号：130611）所购饮片]。

表1 样品含量测定结果（n＝3，μg/g）Tab 1 Results of the contents determination of samples（n＝3，μg/g）

3 讨论

本研究结果表明，硫磺熏蒸北沙参中5种香豆素类成分含量均低于未熏蒸北沙参。为进一步证实北沙参中5 种香豆素类成分的减少与硫磺熏蒸有关，笔者对收集的4批未熏蒸北沙参进行硫磺熏蒸处理后，分别对其进行含量测定，经与未熏蒸北沙参比较，发现5 种香豆素类成分的含量明显减少，说明硫磺熏蒸可导致北沙参中补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、欧前胡素、异欧前胡素含量减少，但具体机制尚不明确，需进一步研究。

目前，虽有学者对硫磺熏蒸药材的鉴别进行了相关的研究工作[5]，但尚不成熟。为防止中药材粗加工过程中滥用或过度使用硫磺熏蒸的问题，保证中药的质量和用药安全，2010年版《中国药典第二增补本》中收载了中药材及饮片的SO2残留量标准，除山药、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白术、党参10 种中药材及饮片中亚硫酸盐残留量（以SO2计）不得超过400 mg/kg外，其余中药材及饮片中亚硫酸盐残留量均不得超过150 mg/kg[6]。为保证中药材及饮片低硫或无硫，必须规范药材产地加工方法，研究先进的饮片贮藏保管技术，加强监管力度，以确保中药饮片的用药安全和疗效。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：205.

[2]刘晓，马晓青，蔡皓，等.ICP-AES法检测硫磺熏蒸前后金银花中金属元素及微量元素[J].中成药，2012，34（2）：293.

[3]Wang XH，Xie PS，Lam Chris WK，et al.Study of the destructive effect to inherent quality of Angelicae dahuricae radix（BaiZhi）by sulfur-fumigated process ueing chromatographic fingerprinting analysis[J].J Pharm Biomed Anal，2009，49（5）：1 221.

[4]黄山君，王瑞，石燕红，等.硫磺熏制白芍的安全性评价初步研究[J].药学学报，2012，47（4）：486.

[5]钟越，雷钧涛，曹渊.枸杞子和硫熏枸杞子的鉴别[J].中国药房，2008，19（27）：2 138.

[6]国家药典委员会.中国药典：第二增补本[S].北京：中国医药科技出版社，2013：206.