RP-HPLC法测定二十味肉豆蔻散中去氢二异丁香酚的含量Δ

杨巧虹，康新莉，周雪杉，阿 萍，顾 健，谭 睿#（1.重庆医疗器械质量检验中心，重庆 0117；.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 61001；.西藏自治区药品检验所，拉萨 850000；.西南民族大学民族医院研究院，成都 610051）

肉豆蔻散是由肉豆蔻、沉香、丁香、降香、藏茴香和余甘子等20 味藏药材组方的复方制剂[1]。二十味肉豆蔻散是在丸剂的基础上改制的新剂型，具有易分散、起效快的特点，较丸剂的适用范围更广。新剂型的开发，需要对其主要药效成分的含量进行控制，以确保其临床疗效。为此，笔者参考有关文献[2-3]，建立了采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定二十味肉豆蔻散中去氢二异丁香酚的含量，以为二十味肉豆蔻散的质量标准提供可靠依据。

1 材料

LC-10A 型HPLC 仪，包括CLASS-VP5.03 色谱工作站（日本岛津公司）；SK7200LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；BSA224S型电子天平（德国赛多利斯公司）。

二十味肉豆蔻散（批号：20111205、20111021、20120214）、缺肉豆蔻的阴性样品均由青海省藏医院制剂科提供；去氢二异丁香酚对照品（成都市食品药品检测中心，批号：110725-201112）；甲醇为色谱纯，无水乙醇、乙酸乙酯为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Comatex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（68∶32，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：276 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取去氢二异丁香酚对照品0.5 mg，加甲醇定容至10 ml量瓶中，摇匀，作为对照品母液；精密量取上述对照品母液1 ml，置于50 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 称取样品粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇40 ml，称定质量，超声（功率：120 W，频率：40 kHz）处理40 min，放冷，再次称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取缺肉豆蔻的阴性样品适量，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 系统适用性试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，色谱见图1。理论板数按去氢二异丁香酚计均不低于3 000，分离度＞1.5。

2.4 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.供试品溶液；B.对照品溶液；C.阴性对照溶液；1.去氢二异丁香酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.solution of test sample；B.solution of reference；C.solution of negative control；1.dehydrodiisoeugenol

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液4、7、10、13、16、20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得去氢二异丁香酚的回归方程为y＝4 302 637.68x－80 552.67（r＝0.999 7）。结果表明，去氢二异丁香酚进样量在0.036 8～0.184 0 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，RSD＝1.94%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品（批号：20111205）溶液适量，分别于放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝1.82%（n＝7），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：20111205）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝2.84%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的同一样品（批号：20111205）共6 份，精密称定，置于100 ml具塞锥形瓶中，加入“2.2.1”项下对照品母液130 μl，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，并计算样品含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

在色谱条件的建立过程中，笔者参考相关文献[4-6]分别考察了柱温为25、30、35、40 ℃时的色谱行为。结果表明，柱温对色谱峰影响不大，故选择常用柱温30 ℃。笔者又分别考察了甲醇-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（68∶32，V/V）和甲醇-水（66∶34，V/V）等不同流动相系统，结果甲醇-水（68∶32，V/V）作为流动相时分离度、峰形均较好。取去氢二异丁香酚对照品溶液进行全波长扫描，结果去氢二异丁香酚和肉豆蔻醚的最大吸收波长分别为201、276 nm，但在201 nm波长处流动相的吸收较大，影响基线，故以276 nm为检测波长。

3.2 样品的处理方法

笔者分别以甲醇、80%甲醇、无水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂，结果无水乙醇提取含量最高；又分别比较了超声提取、回流提取、振摇提取的提取率，结果超声提取时提取率较高；又考察了超声10、20、30、40、50、60 min的提取效率，结果提取30 min提取率基本稳定，故选择超声提取30 min。

3.3 测定结果的分析

由于本试验仅局限于3批样品，去氢二异丁香酚的平均含量为0.109 mg/g，为了对其质量标准的制订提供依据，建议质量控制时样品中去氢二异丁香酚的含量不得低于0.098 mg/g。

[1]WS3-BC-0164-95.中华人民共和国卫生部药品标准：藏药：第一册：肉豆蔻散[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：142-143.

[3]谭锐，张良.藏药二十味肉豆蔻丸中丁香酚的HPLC测定[J].中国药事，2003，17（4）：224.

[4]袁子民，陈剑锋，贾天柱.RP-HPLC测定麸煨肉豆蔻中去氢二异丁香酚的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（18）：60.

[5]王旭梅，庞玉华.肉蔻五味丸质量标准研究[J].中国药房，2008，19（30）：2 382.

[6]田伟刚.肉豆蔻提取物的药理作用[J].中国社区医师：医学专业，2012，14（16）：44.